高效液相色譜法測定小敗毒膏中咖啡酸含量

趙艷波，孫冬梅

（1.吉林省吉林市中醫(yī)院，吉林 吉林 132001； 2.吉林省吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132001）

小敗毒膏為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第八冊）收載的品種，由蒲公英、金銀花、天花粉、當(dāng)歸、黃柏、赤芍、等16味中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，臨床用于濕熱蘊結(jié)、熱毒雍盛引起的瘡瘍初起、紅腫硬痛、風(fēng)濕疙瘩、周身刺癢、乳癰脹痛、大便燥結(jié)，療效良好。方中蒲公英為主藥，咖啡酸為其主要有效成分。為了更好地控制制劑質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定小敗毒膏的咖啡酸含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC-2010A型高效液相色譜儀?？Х人釋φ掌罚ㄅ枮?85-200001，中國藥品生物制品檢定所）；小敗毒膏（批號為061011，061105，061107，藥都制藥集團(tuán)股份有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Technologies Zorbax Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.01 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（23 ∶77）；檢測波長：323 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取110℃下干燥至恒重的咖啡酸對照品適量，加甲醇制成0.1 g/L的對照品貯備液，再精密量取該貯備液適量，加甲醇制成20 μg/mL的對照品溶液。取樣品約2 g，精密稱定，置燒杯中，加水3 mL，置水浴溫?zé)?，并攪拌使溶散，加硅藻? g，拌勻，置100℃烘箱中烘干，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞錐形瓶中，并用3 mL水洗滌燒杯及玻棒，洗液并入錐形瓶中，置100℃烘箱中烘干，精密加5%甲酸的甲醇溶液10 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用5%甲酸的甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心處理，取上清液，即得供試品溶液[1]。取處方中除蒲公英外的其余藥材的1/10量制成膏劑，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μL注入液相色譜儀，色譜圖見圖 1?？梢?，陰性對照無干擾，方法可行。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品貯備液適量，分別置10 mL量瓶中，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度分別為 1.00，5.00，10.00，20.00，30.00，40.00 μg/mL 的溶液，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾。精密吸取續(xù)濾液注入液相色譜儀。以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=2.58×108C-3.29×104，r=0.999 6（n=6）。結(jié)果表明，咖啡酸質(zhì)量濃度在 1.00～40.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液（20.00 μg/mL）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣。結(jié)果峰面積的 RSD為0.5%（n=5），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，在 0，4，8，12，24 h 時分別測定。結(jié)果的 RSD為0.7%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗：取同一批樣品（批號為061011），依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果含量的 RSD為1.1%（n=5），表明方法重現(xiàn)性較好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品（批號061011，含量68.10 μg/g）適量，共6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入咖啡酸對照品適量，按供試品溶液制備方法操作，依法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果批號為 061011，061105，061107的3批樣品中咖啡酸含量分別為68.10，72.85，66.23 μg/g（n=5），經(jīng)綜合考慮，確定限量為每克含咖啡酸不得低于 40 μg。

圖1 高效液相色譜圖

表1 咖啡酸加樣回收試驗（n=6）

3 討論

試驗中采用了不同的流動相，如甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（23∶77，pH 為 3.8～4.0）、甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（25∶75，pH 為 3.8～4.0）。結(jié)果表明，以前者為流動相時，色譜圖基線較穩(wěn)[2]。本方法準(zhǔn)確、簡便，重現(xiàn)性及回收率均理想，故可以作為小敗毒膏的質(zhì)量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：244-245.