阿魏酸鈉對博來霉素肺纖維化大鼠肺組織TGFβRmRNA表達(dá)的影響

穆茂 程德云 聶莉 楊禮騰 胡曉波 方詢 陳文彬

阿魏酸鈉對博來霉素肺纖維化大鼠肺組織TGFβRmRNA表達(dá)的影響

穆茂 程德云 聶莉 楊禮騰 胡曉波 方詢 陳文彬

目的 觀察阿魏酸鈉對肺纖維化大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA表達(dá)的影響，探討其治療肺纖維化的作用及機(jī)制。方法 將30只SD大鼠隨機(jī)分為對照組，肺纖維化模型組和阿魏酸鈉治療組，每組10只。模型組和治療組以氣管內(nèi)滴入博來霉素(5mg/kg)建立肺纖維化動物模型，治療組采用阿魏酸鈉(150mg/kg體重)灌胃治療。HE染色檢測肺組織病理改變，免疫組化檢測Ⅰ型膠原纖維，原位雜交檢測轉(zhuǎn)化生長因子β受體ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)。結(jié)果 與對照組比較，肺纖維化模型組肺組織Ⅰ型膠原纖維顯著增加(P＜0.001)。阿魏酸鈉治療組與肺纖維化模型組比較，肺組織內(nèi)1型膠原纖維表達(dá)減弱(P＜0.001)，TGFβRⅡmRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。結(jié)論 阿魏酸鈉能有效地減輕肺纖維化大鼠肺組織的纖維化程度，其機(jī)制可能與其抑制肺內(nèi)TGFβRⅡmRNA的表達(dá)，從而阻止Ⅰ型膠原過度沉積有關(guān)。

阿魏酸鈉；肺纖維化；1型膠原纖維；轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ受體

肺纖維化主要的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡導(dǎo)致膠原纖維代謝失衡。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)在其細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[1]。TGFβ1主要是通過與成纖維細(xì)胞上的TGFβRⅡ結(jié)合從而激活TGFβ/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使膠原過度沉積導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。在治療上，主要給予腎上腺糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，但效果不甚理想且副作用明顯，而具有活血化淤功效的中藥在防治器官纖維化方面具有良好的前景。近年來有研究顯示，阿魏酸鈉對大鼠肝纖維化和腎間質(zhì)纖維化具有一定的抑制作用[2-3]，但關(guān)于阿魏酸鈉能否抑制肺纖維化，目前報道較少。有鑒于此，我們以大鼠氣管內(nèi)滴入博來霉素建立肺纖維化模型，通過分析阿魏酸鈉對大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA及Ⅰ型膠原纖維表達(dá)的影響，初步探討阿魏酸鈉對肺纖維化的療效，為其治療肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物和試劑：選擇7周齡二級健康SD大鼠30只 (四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重150g～250g，雌雄各半；阿魏酸鈉(成都亨達(dá)藥業(yè)有限公司)；博萊霉素(15mg/支)；麗春紅S(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)，維多利亞蘭B(上?；瘜W(xué)試劑公司)，兔抗大鼠Ⅰ型膠原抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ受體ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)②主要儀器：TE2000-u熒光相差倒置生物顯微鏡，COOLPIX450高級數(shù)碼相機(jī)，Imagepro plus專業(yè)圖像分析軟件。

1.2 將大鼠隨機(jī)分為3組 對照組、肺纖維化組和阿魏酸鈉治療組，每組10只大鼠。肺纖維化組和阿魏酸鈉治療組大鼠氣管內(nèi)滴入博萊霉素(5mg/kg體重，溶于0.3ml生理鹽水)，建立肺纖維化模型。對照組予等量生理鹽水氣管內(nèi)滴入。從第2天起，阿魏酸鈉治療組大鼠每天給予阿魏酸鈉(150mg/kg體重，溶于3ml生理鹽水)灌胃，肺纖維化組和對照組大鼠予以3ml生理鹽水灌胃,共28天。第29天，處死大鼠，剪下左肺下葉于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，分別進(jìn)行HE染色、免疫組化法(S-P法)檢測I型膠原纖維，原位雜交試檢測TGFβRⅡmRNA。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。圖像采集及分析定量：利用由TE2000-u熒光相差倒置生物顯微鏡，COOLPIX450高級數(shù)碼相機(jī)，Image-proplus專業(yè)圖像分析軟件構(gòu)成的圖像采集和分析系統(tǒng)，于免疫組化切片的上下左右四個視野各采集一張100倍的圖像，每張圖像先進(jìn)行顏色分離，然后自動計算肺組織內(nèi)Ⅰ型膠原纖維的積分光密度(IOD)值，4張圖像的IOD平均值作為該片肺組織內(nèi)Ⅰ型膠原纖維的IOD代表值。對于TGFβRⅡmRNA原位雜交切片，同樣先用軟件進(jìn)行顏色分離，然后采用相同的方法計算肺組織TGFβRⅡmRNA的IOD代表值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理改變和細(xì)胞數(shù)采集結(jié)果 對大鼠肺組織HE染色切片進(jìn)行觀察可見，對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔無明顯充血及水腫，肺泡內(nèi)未見明顯炎性細(xì)胞。模型組肺泡間隔明顯增寬伴明顯充血水腫，重度纖維組織增生，肺泡腔變形，其中含有較多炎性細(xì)胞。阿魏酸鈉治療組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡間隔增寬較模型組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤較輕，纖維化改變不明顯。

2.2 免疫組化檢測Ⅰ型膠原纖維結(jié)果 對照組I型膠原纖維僅在氣管周圍弱表達(dá)；而在模型組中，I型膠原纖維廣泛分布于支氣管上皮下組織、肺間質(zhì)及血管周圍；經(jīng)過阿魏酸鈉治療后，表達(dá)于支氣管上皮下組織、肺間質(zhì)及血管周圍的Ⅰ型膠原纖維明顯減少。模型組Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)(0.97±0.34)明顯高于對照組(0.27±0.08)(P＜0.001)；阿魏酸鈉治療組(0.39±0.25)較模型組表達(dá)減弱，差異有顯著性(P＜0.001)，而與對照組比較沒有明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA比較 原位雜交染色可見，對照組肺組織形態(tài)正常，可見少許散在炎性區(qū)，TGFβRⅡmRNA表達(dá)較少。模型組肺組織肺泡壁明顯增厚，在增厚的肺泡壁及血管周圍可見明顯TGFβRⅡmRNA表達(dá)；阿魏酸鈉治療組肺組織內(nèi)TGFβRⅡmRNA表達(dá)降低。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠肺組織I型膠原纖維的表達(dá)情況(±s)

表1 各組大鼠肺組織I型膠原纖維的表達(dá)情況(±s)

注：與對照組比較 *P＜0.001**P＞0.05；與模型組比較，#P＜0.001

組別 樣本數(shù) I型膠原纖維(IOD)對照組 9 0.27 ± 0.08模型組 10 0.97 ± 0.34*阿魏酸鈉治療組 9 0.39 ± 0.25 **#

表2 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA的表達(dá)情況(±s)

表2 各組大鼠肺組織TGFβRⅡmRNA的表達(dá)情況(±s)

注：與對照組比較 *P＜0.01**P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 樣本數(shù) TGFβRⅡmRNA(IOD)對照組 9 0.078 ± 0.035模型組 10 0.178 ± 0.090*阿魏酸鈉治療組 9 0.121 ± 0.025**#

3 討論

肺纖維化的主要病理特點(diǎn)是早期的彌漫性肺泡炎和后期大量成纖維細(xì)胞的病理性增生及基質(zhì)膠原纖維進(jìn)行性積聚并取代正常肺組織結(jié)構(gòu)[4]。膠原纖維是肺組織的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。正常情況下，肺內(nèi)膠原代謝處于動態(tài)平衡，對維持肺間質(zhì)和肺泡的正常結(jié)構(gòu)和功能起著非常重要的作用。博萊霉素氣管內(nèi)一次性注入制備的肺纖維化大鼠模型是目前公認(rèn)的比較符合肺纖維化病理演變的模型[5]。本實(shí)驗(yàn)中，HE切片顯示模型組肺泡組織明顯充血、水腫，表明模型組的纖維化程度嚴(yán)重。免疫組化顯示，對照組I型膠原纖維僅在氣管周圍弱表達(dá)，而模型組I型膠原纖維廣泛分布于支氣管上皮下組織、肺間質(zhì)及血管周圍，且表達(dá)較對照組有顯著差異(P＜0.001)。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠纖維化模型。

阿魏酸鈉是當(dāng)歸、川芎等多種中藥的有效成分。藥理研究認(rèn)為，阿魏酸鈉為非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，可拮抗內(nèi)皮素引起的血管收縮、升壓及血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，從而可減輕血管內(nèi)皮損傷；并且有抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學(xué)等作用。此外還具有清除自由基、增強(qiáng)免疫功能等多種藥理作用[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸鈉治療組肺組織的病理學(xué)改變較肺纖維化組有較大改善，纖維化程度明顯減輕；阿魏酸鈉治療組I型膠原纖維含量也較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，這提示阿魏酸鈉具有一定的抗肺纖維化作用。

TGFβRⅡ是肺纖維化過程中炎性細(xì)胞因子TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的一種細(xì)胞表面受體，為含有絲氨酸/蘇氨酸激酶的糖蛋白。TGF-β在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，先要與特異性Ⅱ型受體結(jié)合，通過形成受體四聚體復(fù)合物，繼而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。有研究報道，在動物實(shí)驗(yàn)中，可溶性Ⅱ型受體抗體中和TGF-β可以阻止TGF-β與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合，顯著減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

我們的結(jié)果顯示，經(jīng)阿魏酸鈉治療后，TGFβRⅡmRNA的表達(dá)較模型組降低(P＜0.05)。進(jìn)一步提示阿魏酸鈉可能通過減少TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵受體分子TGFβRⅡmRNA的表達(dá)，抑制TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使I型膠原纖維合成減少，從而起到抗纖維化的作用。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2010.21.057

550004 貴州貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科 (穆茂)610041四川成都大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (程德云 聶莉 楊禮騰 胡曉波 方詢陳文彬)

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