豬腦心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆與序列分析*

陳進(jìn)喜,施開(kāi)創(chuàng),屈素潔,鄭 敏,李向濤,陳宏備,許瑞勝

(1.欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西欽州 535000;2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧 530001;3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)

豬腦心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆與序列分析*

陳進(jìn)喜1,施開(kāi)創(chuàng)2*,屈素潔2,鄭 敏2,李向濤3,陳宏備3,許瑞勝3

(1.欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西欽州 535000;2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧 530001;3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)

應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增豬腦心肌炎病毒GXLC株的VP1基因,擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD 18-T載體后進(jìn)行測(cè)序,對(duì)獲得的VP1基因序列進(jìn)行分析。序列分析表明,GXLC株VP1基因長(zhǎng)度為831 bp,編碼277 aa,含有2個(gè)潛在的N-糖基化基序和9個(gè)抗原表位。同源性分析表明,GXLC株與國(guó)內(nèi)外其他26個(gè)EMCV分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間。遺傳進(jìn)化分析表明,基于VP1基因序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以將所有EMCV分離株分成兩個(gè)群,即Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再細(xì)分為Ⅰa亞群和Ⅰb亞群,其中豬源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV則分布在Ⅱ群;GXLC株與其他中國(guó)分離株均屬于Ⅰa亞群。

豬;腦心肌炎病毒;VP1基因;分子特征

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于微RNA病毒科心病毒屬,可以感染多種家畜、野生動(dòng)物和人類(lèi),鼠類(lèi)是其自然貯存宿主。EMCV主要引起斷奶仔豬的腦炎、心肌炎、突然死亡及母豬的繁殖障礙。EMCV在病毒粒子形成過(guò)程中,其前體蛋白最終裂解為結(jié)構(gòu)蛋白1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)和非結(jié)構(gòu)蛋白 2A、2B、2C 、3A 、3B、3C 、3D。其中,結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 的抗原性最強(qiáng),且與病毒粒子表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、抗原性、受體吸附及脫殼有關(guān)[1-2]。VP1蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體具有中和活性,可以中和EMCV在小鼠體內(nèi)的感染能力,表明VP1蛋白是 EMCV重要的保護(hù)性抗原[3-4]。VP1基因核苷酸突變導(dǎo)致所編碼氨基酸的變異可造成病毒血凝活性的喪失、病毒受體結(jié)合位點(diǎn)的改變,從而導(dǎo)致EMCV在致糖尿病型和非糖尿病型之間的轉(zhuǎn)變[5-6],表明VP1基因?qū)MCV的致病性發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)EMCV GXLC株VP1基因進(jìn)行克隆和分子特征分析,為進(jìn)一步開(kāi)展EMCV的致病和免疫機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 EMCV GXLC株于2008年5月從廣西陸川縣某豬場(chǎng)一頭表現(xiàn)為急性心肌炎、經(jīng) realtime PCR檢測(cè)為EMCV陽(yáng)性[7]的斷奶仔豬的心、脾組織中分離和鑒定,GenBank登錄號(hào)為FJ897755[8],由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離并保存。病毒在BHK-21細(xì)胞系上傳至第3代用于VP1基因序列測(cè)定。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HindⅢ和EcoRⅠ限制酶、膠回收試劑盒、pMD 18-T載體等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司;E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物 參考豬EMCV BJC3株(GenBank登錄號(hào):DQ464062)基因序列,設(shè)計(jì)并合成覆蓋完整VP1基因的特異性引物 EMCV-VP1-F:5′-ACTCAAGATGCCTATCTCAC-3′和 EMCV-VP1-R:5′-CCAAAAT TGTCCATGTCTAAAC-3′,擴(kuò)增預(yù)期大小為979 bp的基因片段。

1.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR 取細(xì)胞培養(yǎng)后的病毒上清液,按試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA。采用九聚體寡核苷酸引物為反轉(zhuǎn)錄引物,以總RNA為模板,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。以cDNA為模板,應(yīng)用特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增 。25 μ L 反應(yīng)體系:cDNA 模板 2.0 μ L,10 ×緩沖液 2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/μ L)2.0 μ L,TaqDNA 聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,上、下游引物(25 pmol/μ L)各 0.5 μ L,ddH2O 17 μ L 。 反應(yīng)參數(shù):94℃5 min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后,以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與VP1基因序列的測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后,采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化的目的片段與pMD 18-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑出陽(yáng)性克隆,增菌培養(yǎng)后,用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定。測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司采用M13和M13RV通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。利用DNA Star軟件包中的SeqMan程序和測(cè)序峰圖軟件Chromas2.22對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,獲得VP1基因序列。

1.2.4 VP1蛋白特性分析 運(yùn)用DNA Star軟件包中的Protean程序?qū)MCV GXLC株VP1蛋白的親水性(Kyte-Doolittle法預(yù)測(cè))、抗原指數(shù)(Jameson-Wolf法預(yù)測(cè))、表面可能性(Emimi法預(yù)測(cè))進(jìn)行分析。

1.2.5 VP1基因同源性分析 運(yùn)用DNA Star軟件包,對(duì)GXLC株及從NCBI GenBank下載的其他26株EMCV參考毒株(見(jiàn)表1)VP1基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.6 VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于EMCV VP1基因的核苷酸序列,運(yùn)用MEGA3.1軟件包中的Neighbor-joining方法,以Mengo-M分離株作為外類(lèi)群(outgroup)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 EMCV VP1基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定

應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR,得到與預(yù)期目的片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)純化、連接到pMD 18-T載體、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,獲得陽(yáng)性克隆菌。經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定,表明已成功獲得EMCV VP1基因的重組質(zhì)粒(圖1)。

圖1 EMCV VP1基因的重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid with VP1 gene of EMCV

2.2 EMCV VP1基因序列

對(duì)重組質(zhì)粒中插入的VP1基因目的片段進(jìn)行雙向測(cè)序和拼接后,獲得EMCV GXLC株VP1基因序列,全長(zhǎng)為831 bp,編碼 277 aa(圖2)。

圖2 EMCV GXLC株VP1基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 T he nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VP1 gene of EMCV GXLC strain

2.3 VP1蛋白特性分析及其抗原表位預(yù)測(cè)

GXLC株的VP1蛋白由277 aa組成,有2個(gè)潛在的N-糖基化基序,分別為N29QT和N62QT。按照Kyte-Doolittle法的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn),VP1蛋白親水性較高的區(qū)域主要在0～17、25～36、37～42、75～113、147～ 158、164～ 175、202～ 212、239～ 249和259～268位氨基酸區(qū)段;根據(jù) Emimi原則推測(cè),VP1蛋白的 11～ 15、27～32、38～ 41、73～ 90、96～100、106 ～ 111、149～155、166～ 173、203 ～ 210 和239～245位氨基酸區(qū)段出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面的可能性比較大,而且這些區(qū)段均位于VP1蛋白的親水區(qū)域;根據(jù)Jameson-Wolf法預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,VP1蛋白大多數(shù)區(qū)域的抗原性指數(shù)都比較高,其中1～18、26～ 33、37～ 44、48～ 58、74～ 90、93～ 102、104～ 112、147～ 156、163 ～172、203～ 214、217～ 225、229～237、247～252和258～272位氨基酸區(qū)段的抗原指數(shù)最為顯著(圖3)。根據(jù)以上結(jié)果,預(yù)測(cè) EMCV GXLC株VP1有9個(gè)抗原表位,分布在EPVP1-1(P27ENQTK)、EPVP1-2(Y37DRSS)、EPVP1-3(A80YDQLR PQRLT)、EPVP1-4(G96NEETS)、EPVP1-5(K107SKQDY)、EPVP1-6(T150PTKPT T)、EPVP1-7(G168RTPQV)、EPVPVP1-8(G204HKRFD)和EPVP1-9(Y242KNMRV)。

圖3 EMCV GXLC株VP1蛋白特性預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction on antigen sites and some characters of VP1 protein of EMCV GXLC strain

2.4 VP1基因同源性分析

將GXLC株VP1基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其它參考毒株進(jìn)行同源性比較的結(jié)果見(jiàn)表1。GXLC株與國(guó)內(nèi)外分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間。其中,GXLC株與GX0601、GX0602、BJC3、HB1等中國(guó)分離株的核苷酸同源性高達(dá)99.2%以上、氨基酸序列同源性在98.6%以上。值得注意的是,GXLC株與其他分離株VP1基因的核苷酸序列同源性最低僅為78.6%,而氨基酸序列同源性均在95.1%以上,說(shuō)明部分核苷酸堿基的突變并未導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變,屬于沉默突變。

2.5 VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于EMCV VP1基因核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4),EMCV可分為2個(gè)群:Ⅰ群和Ⅱ群,而I群又可以進(jìn)一步細(xì)分為Ⅰa亞群和Ⅰb亞群。豬源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV則分布在Ⅱ群。值得注意的是,來(lái)源于亞洲國(guó)家的EMCV分離株均分布在Ⅰa亞群,而Ⅱ群中的豬源分離株均來(lái)源于歐洲國(guó)家。GXLC株與中國(guó)其他分離株均屬于Ⅰa亞群。

表1 GXLC株與其他EMCV參考株VP1基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較Table 1 Homological comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of VP1 gene of GXLC strain with other EM CV isolates

圖4 基于EMCV VP1基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on EMCV VP1 gene nucleotide sequences

3 討論

EMCV的中和表位主要存在于VP1、VP2和VP3,其中VP1是EMCV最重要的中和性抗原表位所在的區(qū)域[1,9]。原核表達(dá)的VP1蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)證實(shí)具有抗原活性[10],以VP1蛋白免疫小鼠可以產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體、提供針對(duì)EMCV的保護(hù)力[2-4],因此可以將VP1制備診斷抗原,同時(shí)VP1基因在設(shè)計(jì)基因工程疫苗時(shí)也有重要的應(yīng)用價(jià)值。序列分析表明,EMCV GXLC株VP1基因長(zhǎng)度為831 bp,編碼277 aa,預(yù)測(cè)存在9個(gè)抗原表位,分布在27～ 32、37～ 41、80～ 90、96～ 101、107～ 112、150～156、168～173、204～209和 242～247位氨基酸區(qū)段。對(duì)于這些抗原表位的預(yù)測(cè),可以利用噬菌體展示技術(shù)等方法加以證實(shí)。

同源性比較表明,不同來(lái)源的EMCV分離株多以結(jié)構(gòu)蛋白VP1變異最大[8],同時(shí)VP1是 EMCV最重要的中和性抗原表位所在的區(qū)域[1],因此VP1成為EMCV研究的重點(diǎn)。本研究中,GXLC株與其他分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間,變異較大,提示 EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1作為病毒主要中和表位所在的區(qū)域,受到選擇壓力的影響,VP1基因不斷發(fā)生變異以維持EMCV的存活。同時(shí),VP1氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間,提示在選擇壓力下多數(shù)核苷酸的變異屬于沉默變異,并沒(méi)有導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變,VP1的結(jié)構(gòu)和功能仍得以保持。由于VP1是EMCV最重要的中和性抗原表位所在區(qū)域,也是基因序列變異較大的區(qū)域,對(duì)VP1的分析能使我們對(duì)EMCV的致病性及遺傳變異有更好的了解,因此VP1基因成為開(kāi)展EMCV分子流行病學(xué)研究的重點(diǎn)區(qū)域[11-12]。

基于VP1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),可將所有EMCV分離株區(qū)分為Ⅰ群和Ⅱ群,豬源、鼠源EMCV在兩個(gè)群中均有分布,并且親緣關(guān)系很近,所以鼠類(lèi)傳播EMCV的作用不容忽視。有研究發(fā)現(xiàn),鼠類(lèi)是豬腦心肌炎暴發(fā)流行風(fēng)險(xiǎn)因子中的關(guān)鍵因素[13],發(fā)病豬場(chǎng)內(nèi)及周邊的老鼠體內(nèi)可以檢測(cè)出EMCV,而老鼠本身不表現(xiàn)任何異常癥狀,僅是作為EMCV貯存庫(kù)存在[14-15]。因此,搞好豬場(chǎng)內(nèi)及周邊的滅鼠工作對(duì)有效防控豬腦心肌炎至關(guān)重要。最近,Oberste M S等[16]報(bào)道從秘魯兩名表現(xiàn)惡心、頭痛和呼吸困難的病人血清中分離到EMCV,對(duì)病毒VP1基因90%的序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與豬源EMCV分離株的同源性高達(dá)91.7%～99.9%。本研究中,2株人源 EMCV分離株(Peru-2004/10854、Peru-2004/10855株)在進(jìn)化樹(shù)中屬于Ⅱ群,與同群的豬源、鼠源EMCV分離株親緣關(guān)系很近,因此,人、豬、禽在EMCV感染與傳播中的相互關(guān)系令人矚目。但是,由于人源EMCV分離株及其基因序列的信息極少,要準(zhǔn)確分析腦心肌炎暴發(fā)流行中人、豬、禽的作用及相互關(guān)系,還有待于EMCV分子流行病學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究的進(jìn)一步積累。

不同EMCV分離株其致病性有所差異[17]。研究表明,VP1基因與病毒致病性密切相關(guān)[11]。Nelsen-Salz B等[5]發(fā)現(xiàn)致糖尿病(PV2株)與非致糖尿病(PV7株)EMCV變異株的差異僅僅是VP1第63位氨基酸殘基發(fā)生突變(Gln→Glu)。Denis P等[18]報(bào)道,引起仔豬心肌炎的一株病毒(BEL-279/95株)在BHK-21細(xì)胞系中傳210代后,對(duì)仔豬的致病性減弱,其VP1第62位氨基酸殘基發(fā)生突變(Asn→Asp)。Guy M 等[19]將EMCV 1086C株在大鼠BRL細(xì)胞傳代29代后,病毒適應(yīng)了細(xì)胞,產(chǎn)生高滴度的病毒和明顯的細(xì)胞病變,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是VP1第49位氨基酸殘基發(fā)生了突變(Lys→Glu),使病毒獲得與細(xì)胞表面受體唾液酸殘基結(jié)合的能力。而上述VP1第49、62、63位氨基酸殘基均位于 EMCV第4個(gè)中和表位,并且處在連接VP1 βB和βC鏈的連接環(huán)的表面從而易于與細(xì)胞受體結(jié)合,提示EMCV對(duì)應(yīng)于第4個(gè)中和表位的區(qū)域與細(xì)胞表面受體、病毒致病性有關(guān)[19]?？梢?jiàn),VP1與受體結(jié)合、病毒中和及病毒毒力之間具有密切聯(lián)系。因此,研究EMCV毒株VP1基因的分子特征,有助于分析分離株的毒力與致病作用。GXLC株與國(guó)內(nèi)外其他EMCV分離株VP1氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間,與 PV2株、BEL-279/95株、1086C 株分別有5、4、4個(gè)氨基酸的差異。目前,GXLC株對(duì)豬、鼠的致病性研究正在進(jìn)行之中。

[1]Racaniello V R.Picornaviridae:The viruses and their replication,in Knipe D M,Howley P M,Griffin D E,et al.Fields Virology[M].4th Edition.Lippincott Williams&Wilkins Publishers,2001:685-715.

[2]M orishima T,Mcclintock P R,Aulakh G S,et al.Genomic and receptor attachment differences between Meng ovirus and encephalomyocarditis virus[J].Virology,1982,122(2):461-465.

[3]Sin J I,Sung J H,Suh Y S,et al.Protective immunity against heterologous challenge with encephalomyocarditis virus by VP1 DNA vaccination:effect of coinjection with a granulocy te-macrophage colony stimulating factor gene[J].Vaccine,1997,15(17-18):1827-1833.

[4]Suh Y S,Ha S J,Lee C H,et al.Enhancement of VP1-specific immune response and protection against EM CV-K challenge by co-delivery of IL-12 DNA with VP1 DNA vaccine[J].Vaccine,2001,19(15-16):1891-1898.

[5]Nelsen-Salz B,Zimmermann A,Wickert S,et al.Analysis of sequence and pathogenic properties of two variants of encepha-lomy ocarditis virus differing in a single amino acid in VP1[J].Virus Res,1996,41(2):109-122.

[6]Bae Y S,Eun H M,Yoon J W.Genomic differences between the diabetogenic and non-diabetogenic variants of encephalomyocarditis virus[J].Virology,1989,170(1):282-287.

[7]施開(kāi)創(chuàng),陳進(jìn)喜,屈素潔,等.豬腦心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2009,39(2):135-139.

[8]施開(kāi)創(chuàng),屈素潔,陳進(jìn)喜,等.豬源腦心肌炎病毒GXLC株全基因組序列測(cè)定與分析[J].病毒學(xué)報(bào),2010,26(2):134-142.

[9]Koenen F,Vanderhallen H,Papadopoulos O,et al.Comparison of the pathogenic,antigenic and molecular characteristics of two encephalomyocarditis virus(EMCV)isolates from Belgium and Greece[J].Res Vet Sci,1997,62(3):239-244.

[10]蓋新娜,楊漢春,郭 鑫,等.豬腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的克隆與原核表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,42(11):9-11.

[11]Koenen F,Vanderhallen H,Castryck F,et al.Epidemiologic,pathogenic and molecular analysis of recent encephalomyocarditis outbreaks in Belgium[J].Zentralbl Vet Med B,1999,46(4):217-231.

[12]An D J,Jeong W,Jeoung H Y,et al.Encephalomy ocarditis in Korea:serological survey in pigs and phylogenetic analysis of two historical isolates[J].Vet Microbiol,2009,137(1-2):37-44.

[13]M aurice H,Nielen M,Vyt P,et al.Factors related to the incidence of clinical encephalomyocarditis virus(EMCV)infection on Belgian pig farms[J].Pre Vet Med,2007,78(1):24-34.

[14]Kluivers M,Maurice H,Vyt P,et al.T ransmission of encephalomyocarditis virus in pigs estimated from field data in Belgium by means of R0[J].Vet Res,2006,37(6):757-766.

[15]Billinis C.Encephalomyocarditis virus infection in wildlife species in Greece[J].J Wildl Dis,2009,45(2):522-526.

[16]Oberste M S,Gotuzzo E,Blair P,et al.Human febrile illness caused by encephalomy ocarditis virus infection,Peru[J].Emerg Infect Dis,2009,15(4):640-646.

[17]Kim H S,Christianson W T,Joo H S.Pathogenic properties of encephalomyocarditis virus isolates in swine fetuses[J].A rch Virol,1989,109(1-2):51-57

[18]Denis P,Koenen F.M olecular analy sis of the capsid coding region of a virulent encephalomyocarditis virus isolate after serial cell passages and assessment of its virulence[J].Arch Virol,2003,148(5):903-912.

[19]Guy M,Chilmonczyk S,Crucire C,et al.Efficient infection of buffalo rat liver-resistant cells by encephalomyocarditis virus requires binding to cell surface sialic acids[J].J Gen Virol,2009,90(1):187-196.

Cloning and Sequence Analysis of VP1 Gene of Encephalomyocarditis Virus GXLC Strain Isolated from Swine

CHEN Jin-xi1,SHI Kai-chuang2,QU Su-jie2,ZHENG Min2,LI Xiang-tao3,CHEN Hong-bei3,XU Rui-sheng3

(1.Qinzhou Center for Animal Disease Control and Prevention,Qinzhou,Guangxi,535000,China;2.Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention,Nanning,Guangxi,530001,China;3.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

T he structural protein VP1 gene of encephalomyocarditis virus(EMCV)GXLC strain was amplified by RT-PCR,cloned into a pMD 18-T vector,sequenced and analyzed.The sequence analysis showed that the VP1 gene of GXLC strain consisted of 831 nucleotides encoding 277 amino acides and contained 2 potential N-glycosylation motifs and 9 epitopes.The homology analysis indicated the homology of GXLC strain and other EMCV strains available in GenBank were from 78.6%-99.6%and from 95.1%-99.3%based on the nucleotide and deduced amino acide sequences,respectively.The phylogenetic tree based on the VP1 gene sequences revealed that all the EMCV strains could be divided into two groups:groupⅠand groupⅡ,and groupⅠcould be subdivided into subgroupⅠa and subgroupⅠb.The strains from pig and mouse distributed in groupⅠand groupⅡ,while the strains from human distributed in groupⅡ.GXLC strain,together with other EMCV isolates from China,belonged to subgroupⅠa.

swine;Encephalomyocarditis virus;VP1 gene;molecular characteristic

S852.659.6;Q786

A

1007-5038(2010)08-0045-06

2010-05-25

廣西科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科青0728047);廣西科技創(chuàng)新能力與條件建設(shè)基金項(xiàng)目(08-05-01D)

陳進(jìn)喜(1983-),男,福建云霄人,助理獸醫(yī)師,碩士,主要從事動(dòng)物疫病診斷與防控技術(shù)研究。*通訊作者