板栗毛殼水提液對(duì)大鼠腦缺血再灌注后過(guò)氧化氫酶和單胺氧化酶的影響

周麗霞 黃宏妙 李 靈 羅佩卓 梁曉艷 黃 煥

(廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 南寧 530001)

板栗毛殼是殼斗科植物板栗(castanea mollissima blume)的總苞。據(jù)《中華本草》記載,板栗毛殼具健脾益氣、補(bǔ)腎強(qiáng)筋、清熱散結(jié)、止血之功效,治療丹毒、腫毒等疾病〔1〕。板栗殼含有黃酮類(lèi)、微量元素、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分〔2〕,板栗殼及板栗毛殼的水煎液、醇溶物、乙酸乙酯提取物還具有極強(qiáng)的抗菌、消炎作用和抗凝血、升高白細(xì)胞等生物活性〔3,4〕,而且低毒〔5〕。板栗殼色素具一定的抗氧化作用〔6〕,但其毛殼的抗氧化、抗衰老作用迄今未見(jiàn)有報(bào)道。本研究將通過(guò)觀察板栗毛殼水提液在大鼠腦缺血再灌注損傷后對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)、單胺氧化酶(MAO)的影響,初步研究其抗氧化、抗衰老的作用,使其藥用價(jià)值得到有效開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 雙縮脲試劑盒、MAO測(cè)定試劑盒、CAT測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;板栗毛殼采集于廣西隆安縣那桐鄉(xiāng)那重村,經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物學(xué)教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為殼斗科植物板栗(Castanea mollissima Blume)的總苞。

1.1.2 動(dòng)物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,體重(200±20)g,由廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV-160(日本 shimadzu公司);1411高頻小電刀(上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司);江彎-Ⅰ型 C通用立體定向器(第二軍醫(yī)大學(xué));TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));FSH-Ⅱ高速電動(dòng)勻漿器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器);WXH微型旋渦混合器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng))。

1.2 方法

1.2.1 板栗毛殼水提液的制備 將洗凈干燥后的板栗毛殼粉碎,稱(chēng)取干燥粉末 100 g,用 8倍量純凈水浸泡 1 h,加熱煮沸30 min,濾出水煎液,繼續(xù)分別加 6倍量純凈水再煮 2次,合并水煎液,濃縮至 100ml(相當(dāng)于 1 g生藥/ml)。

1.2.2 動(dòng)物分組 將 48只SD大鼠隨機(jī)分為 4組:無(wú)藥無(wú)手術(shù)組(空白對(duì)照組)、無(wú)藥手術(shù)組、給藥手術(shù)組、給藥無(wú)手術(shù)組。給藥組:每天按 10 ml/kg鼠,用板栗毛殼水提液灌胃。無(wú)藥組:每天灌服等量生理鹽水。灌胃 14d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腦缺血再灌注模型的建立 采用四血管阻斷法〔7〕,即將麻醉大鼠定位頭顱,電凝阻斷左右椎動(dòng)脈;再仰臥定位,掛線(xiàn)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈 15min,灌注 3 h后斷頭處死。

1.2.4 組織勻漿的制備 處死大鼠后,速取其腦、肝、腎、心,用 4℃生理鹽水洗凈,吸干,準(zhǔn)確稱(chēng)重,加入 9倍量生理鹽水,冰冷條件下以 3 000 r/min制成10%的勻漿。在 4～6℃條件下高速低溫離心 20min,取上清液,置冰箱 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 蛋白質(zhì)、CAT、MAO含量的測(cè)定 參照蛋白定量(雙縮脲法)、CAT、MAO測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法及軟件 數(shù)據(jù)用x±s表示,采用組間 t檢驗(yàn),用中國(guó)醫(yī)學(xué)百科統(tǒng)計(jì)軟件包(PEMS V2.1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 板栗毛殼水提液對(duì)大鼠腦、肝、腎、心中CAT活性的影響見(jiàn)表 1。

2.2 蛋白定量測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表 1。各組大鼠各組織蛋白量均比較接近,各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 板栗毛殼水提液對(duì)大鼠心、腦、肝、腎中MAO活性的影響見(jiàn)表 1。

表1 板栗毛殼水提液對(duì)大鼠器官組織勻漿 CAT、蛋白含量、M AO活力的影響(x±s,n=6)

3 討 論

蛋白定量測(cè)定主要是為了求出各組織勻漿蛋白濃度,給CAT和 MAO含量的計(jì)算提供數(shù)據(jù)。由表 2數(shù)據(jù)可知,與無(wú)藥無(wú)手術(shù)組(空白對(duì)照組)比較,無(wú)藥手術(shù)組的 CAT活力明顯降低(P＜0.01),表明腦缺血再灌注損傷后能顯著降低大鼠腦、肝、腎、心組織的 CAT活力;而給藥手術(shù)組或給藥無(wú)手術(shù)組均比無(wú)藥手術(shù)組的 CAT活力明顯升高(P＜0.01或 P＜0.05),表明喂食板栗毛殼水提液后,大鼠機(jī)體組織的CAT活力顯著增強(qiáng)。由表 3數(shù)據(jù)可知,與無(wú)藥無(wú)手術(shù)組(空白對(duì)照組)相比,無(wú)藥手術(shù)組各組織勻漿的 MAO活力顯著增高(P＜0.05),提示腦缺血再灌注損傷后使自由基增加而增強(qiáng)了 MAO的活性。而給藥手術(shù)組或給藥無(wú)手術(shù)組均能顯著降低MAO的活性,與無(wú)藥手術(shù)組相比有顯著差異性(P＜0.01或P＜0.05),表明板栗毛殼水提液對(duì)大鼠組織勻漿的MAO活力有抑制作用。

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細(xì)胞損傷,恢復(fù)血液再灌注后,其缺血性損傷反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象〔8〕。腦缺血再灌注引起腦組織損害的病理機(jī)制包括自由基產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量耗竭、免疫介質(zhì)產(chǎn)生、谷氨酸鹽釋放、離子穩(wěn)態(tài)破壞、酸中毒、凋亡通路激活等。其中,自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的核心環(huán)節(jié),而鈣超載則可能是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的最后通路〔9〕。自由基的過(guò)量產(chǎn)生或抗氧化物酶的活性降低都可引起不同程度的細(xì)胞毒性及瞬時(shí)不可逆損失。因此,只有及時(shí)治療,促進(jìn)體內(nèi)抗氧化物酶活性的增強(qiáng),清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),才能消除炎癥、減輕組織缺血再灌注造成的損傷。

CAT的測(cè)定結(jié)果提示,在腦缺血再灌注損傷后,大鼠腦、肝、腎、心組織中,具有清除自由基作用的 CAT活性減弱,會(huì)導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生而對(duì)組織造成損傷。而給予板栗毛殼水提液灌胃后,可提高大鼠腦、肝、腎、心組織中 CAT的活性,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,從而減輕腦缺血再灌注造成的損傷。

MAO的測(cè)定結(jié)果提示,在腦缺血再灌注損傷后,大鼠腦、肝、腎、心組織可能由于大量自由基的產(chǎn)生增強(qiáng)了 MAO的活性。MAO活性上升會(huì)引起中樞兒茶酚胺水平下降造成生化損害。MAO活性增高,是導(dǎo)致急性腦缺血早期腦內(nèi)去甲腎上腺素(NE)濃度下降,以致出現(xiàn)卒中癥狀的一個(gè)重要原因〔10〕。而給予板栗毛殼水提液灌胃后,能有效抑制 MAO的活性,以減少神經(jīng)元的損害,達(dá)到延緩衰老的效果。

板栗毛殼水提液能提高 CAT活性,顯著降低 MAO活性。其醇溶性物質(zhì)是否也具同樣作用?其降低神經(jīng)元壞死的程度、減少腦缺血再灌注損傷后的卒中癥狀,還有待于進(jìn)一步研究。本研究希望能為藥材的功效、進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 國(guó)家中藥管理局 .中華本草〔M〕.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:2422.

2 趙德義,高文海,花成文,等 .板栗殼化學(xué)成分的初步研究〔J〕.陜西林業(yè)科技,2003;(2):43-7.

3 吳龍?jiān)?凌桂生,許學(xué)健,等 .板栗毛殼的抗菌活性成分〔J〕.中草藥,1991;22(8):370.

4 吳龍?jiān)?凌桂生,許振朝 .板栗殼浸膏抗菌抗炎作用及對(duì)胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響〔J〕.廣西中醫(yī)藥,2002;25(4):54.

5 李?lèi)?ài)媛,貝偉劍,趙 一,等 .板栗毛殼長(zhǎng)期毒性的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),1996;2(4):31.

6 何玲玲,王 新,石中亮,等 .水提板栗殼色素對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用〔J〕.食品與機(jī)械,2006;6:56-57.

7 劉亞君,崔 鶴,謝東萍,等 .Bcl2和 Bax在缺血預(yù)處理保護(hù)海馬神經(jīng)元缺血再灌損傷中的作用〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006;44(3):227-30.

8 韓 敏,劉艷凱,薛 茜 .腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展〔J〕.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006;23(10):75-8.

9 Cristina T,Rosaria G,Dechun W,et al.Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats a time course study〔J〕.Eur J Pharmacol,2003;464(2-3):159-62.

10 許世凱.抗衰老藥物學(xué)〔M〕.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1994:158.