C纖維在電針口面部穴位鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用

劉健華 符文彬 徐振華 劉雪芳 陳杰斯

(廣東省中醫(yī)院針灸科 廣東省中醫(yī)院針灸效應(yīng)規(guī)律及機制重點研究室,廣東 廣州 510120)

筆者的前期研究工作表明,電針口面部的四白穴對內(nèi)臟功能活動具有顯著的調(diào)節(jié)作用〔1,2〕,孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)是其重要的延髓初級中樞〔3〕。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)生理狀況下 C纖維可能是針刺四白穴的感覺傳入的主要途徑〔4〕。四白穴位于眶下孔,受三叉神經(jīng)下頜支的分支眶下神經(jīng)的支配。因此,本研究通過辣椒素選擇性損毀眶下神經(jīng)的 C纖維,觀察病理狀況下電針?biāo)陌籽▽?nèi)臟痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng),探討電針口面部穴位鎮(zhèn)痛作用的傳入途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用體重 180～220 g的成年SD大鼠30只,雌雄不限,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為空白組、內(nèi)臟痛組、電針 +內(nèi)臟痛組、辣椒素 +電針+內(nèi)臟痛組、溶媒 +電針 +內(nèi)臟痛組,每組 6只?？瞻捉M大鼠腹腔注射生理鹽水;內(nèi)臟痛組大鼠腹腔注射乙酸造成內(nèi)臟痛模型;電針 +內(nèi)臟痛組先電針雙側(cè)四白穴20 min(疏密波,2～20 Hz,強度以肉眼可見大鼠局部組織顫動為度),再腹腔注射乙酸造成內(nèi)臟痛模型;辣椒素+電針+內(nèi)臟痛組大鼠首先用辣椒素處理雙側(cè)眶下神經(jīng),術(shù)后 5 d待其完全恢復(fù)后電針雙側(cè)四白穴20 min(刺激參數(shù)同前),再腹腔注射乙酸造成內(nèi)臟痛模型;溶媒 +電針 +內(nèi)臟痛組大鼠用溶媒處理雙側(cè)眶下神經(jīng),其余處理同辣椒素 +電針 +內(nèi)臟痛組。

1.2 試劑與儀器 c-fos免疫組化試劑盒(美國 Santa Cruz)、SABC免疫組化試劑盒(北京中山生物有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。CM1850恒冷箱切片機(德國Leica),G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)。

1.3 穴位定位 采用比較解剖學(xué)進(jìn)行大鼠穴位定位。四白穴位于眶下緣眶下孔凹陷處。

1.4 造模方法

1.4.1 內(nèi)臟痛模型 大鼠清醒狀態(tài)下腹腔注射 0.6%乙酸(10ml/kg)造成大鼠內(nèi)臟痛模型,引起典型的腹部肌肉收縮,同時伴有一側(cè)后肢外伸〔4〕。

1.4.2 眶下神經(jīng)的處理 10%烏拉坦(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,手術(shù)游離出雙側(cè)眶下神經(jīng)約 1 cm,將浸泡在 1.5%辣椒素的棉條包繞在眶下神經(jīng)上。為防治藥液浸潤周圍組織,在其下墊一大小合適的塑料薄膜,20 min后去除棉條和塑料薄膜,縫合切口。溶媒對照組則用浸泡在溶媒(不含辣椒素的20%吐溫 80的石蠟溶液)中的棉條包繞在眶下神經(jīng)上,其余處理與辣椒素組相同。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 扭體反應(yīng) 腹腔注射生理鹽水或乙酸后觀察并記錄60 min內(nèi)大鼠腹部收縮次數(shù)。

1.5.2 c-fos表達(dá) 各組動物經(jīng)處理后存活 2h,開胸經(jīng)升主動脈插管進(jìn)行灌流。先用 0.9%生理鹽水 100 ml快速沖洗血液,然后用含 4%多聚甲醛的 0.1 mol/LPB(p H7.4)400 ml灌注固定 50～60 min。灌注完畢后立即取延髓,置于上述灌流液中后固定 4～6h,再移入 20%蔗糖 PB中過夜(4℃)至組織塊沉底。次日取出組織做連續(xù)冠狀切片,片厚 40μm,切片隔兩張取一張,分?jǐn)?shù)套收集于 0.01 mol/L PBS(pH7.4)中。進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。①切片首先入0.03%的H2O2溶液中,室溫 30 min;②入 0.3%TritonX-100,室溫 30 min;③封閉用 10%正常羊血清,室溫 20 min;④多克隆兔抗 c-fos血清(1∶100,Santa Cruz),置于濕盒中(4℃)冰箱中過夜;⑤用生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG(工作液,北京中山生物有限公司),室溫 1 h;⑥辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素復(fù)合物 S-A/HRP(工作液,北京中山生物有限公司),室溫 1 h;⑦DAB呈色,室溫 3～5 min。上述各步驟之間(第三步除外)均用 0.01mol/L(pH7.4)PBS洗滌 3次,每次 5 min。切片裱于涂有明膠的載玻片上,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。室溫晾干后,光鏡下觀察、計數(shù)?？瞻讓φ沼肞BS替代兔抗 c-fos血清進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)反應(yīng)。替代對照用兔血清稀釋液替代兔抗c-fos血清進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 每只大鼠隨機選取 6張切片,光鏡下計算每張切片孤束核和三叉旁核c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,全部數(shù)據(jù)輸入計算機用 SPSS10.0for Windows軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 扭體反應(yīng) 大鼠腹腔注射 0.6%的乙酸后,引發(fā)典型的內(nèi)臟痛行為反應(yīng) (扭體反應(yīng)),即腹部肌肉收縮,同時伴有一側(cè)后肢外伸。腹腔注射生理鹽水,大鼠不出現(xiàn)扭體反應(yīng)。電針?biāo)陌籽A(yù)處理后 (電針 +內(nèi)臟痛組),由內(nèi)臟痛引發(fā)的腹部收縮次數(shù)明顯減少,與內(nèi)臟痛組比較有顯著差異 〔(43.2±11.19)vs(88.0±16.66),P＜0.01〕;辣椒素處理雙側(cè)眶下神經(jīng)后 (辣椒素+電針 +內(nèi)臟痛組),大鼠腹部收縮的次數(shù)較電針 +內(nèi)臟痛組明顯增加 〔(80.7±13.28)vs(43.2±11.19),P＜0.05〕,與內(nèi)臟痛組大鼠相似 〔(80.7±13.28)vs(88.0±16.66),P＞0.05〕;溶媒處理眶下神經(jīng)后,大鼠腹部收縮的次數(shù)較內(nèi)臟痛組明顯減少 〔(44.3±11.1)vs(88.0±16.66),P＜0.05〕,與電針 +內(nèi)臟痛組相似〔 (44.3±11.1)vs(43.2±11.19),P＞0.05〕。

2.2 NTS的 c-fos表達(dá) 腹腔注射乙酸誘發(fā)NTS大量的c-fos表達(dá),其陽性神經(jīng)元主要分布在 NTS的內(nèi)側(cè)亞核、中間內(nèi)側(cè)亞核以及連合亞核。電針?biāo)陌籽A(yù)處理后(電針+內(nèi)臟痛組),內(nèi)臟痛所致 NTS的c-fos表達(dá)明顯減少,與內(nèi)臟痛組比較有顯著差異〔(45.2±5.85)vs(60.4±5.47),P＜0.05〕;辣椒素處理雙側(cè)眶下神經(jīng)后(辣椒素 +電針 +內(nèi)臟痛組),NTS的 c-fos表達(dá)較電針 +內(nèi)臟痛組明顯增加〔(68.5±10.26)vs(45.2±5.85),P＜0.01〕;溶媒處理后(溶媒 +電針 +內(nèi)臟痛組),NTS的 c-fos表達(dá)與電針 +內(nèi)臟痛組比較無明顯變化〔(50.2±7.02)vs(45.2±5.85),P＞0.05〕。見圖 1。

圖1 各組大鼠NTS的 c-fos表達(dá)(×200)

2.3 三叉旁核(paratrigeminal nucleus,PTN)的 c-fos表達(dá) 腹腔注射乙酸后,PTN可見少量的 c-fos陽性神經(jīng)元;電針?biāo)陌籽A(yù)處理后(電針 +內(nèi)臟痛組),PTN的 c-fos表達(dá)較內(nèi)臟痛組明顯增加〔(22.3±4.72)vs(6±1.32),P＜0.01〕;電針?biāo)陌籽A(yù)處理后(辣椒素 +電針 +內(nèi)臟痛組),PTN的 c-fos表達(dá)較電針 +內(nèi)臟痛減弱〔(11.7±2.44)vs(22.3±4.72),P＜0.05〕;溶媒處理后(溶媒 +電針 +內(nèi)臟痛組),PTN的 c-fos表達(dá)較辣椒素組顯著增加〔(26.3±4.50)vs(11.7±2.44),P＜0.01〕,與電針 +內(nèi)臟痛組比較無明顯變化〔(26.3±4.50)vs(22.3±4.72),P＞0.05〕。見圖 2。

圖2 各組大鼠PTN的 c-fos表達(dá)(×200)

3 討 論

迄今為止人們對疼痛的了解大多來自軀體痛而非內(nèi)臟痛,長期以來一直認(rèn)為內(nèi)臟痛只是軀體痛的一種變化而已。因此,針刺鎮(zhèn)痛的研究也大多以軀體痛為主。辣椒素局部神經(jīng)干給藥能選擇性毀損初級傳人 C纖維,對有髓纖維影響小,而對運動纖維幾乎無影響,是選擇性研究傳入 C纖維的一種非常理想的工具藥。不少學(xué)者通過辣椒素處理支配穴位局部的傳入纖維,對C纖維在針刺鎮(zhèn)痛中的作用進(jìn)行廣泛的探討。劉鄉(xiāng)等〔5〕將辣椒素作用于大鼠一側(cè)的腓總神經(jīng)后,電針足三里對中縫大核神經(jīng)元傷害性反應(yīng)的抑制作用明顯減弱。辣椒素處理后24 h,電針患側(cè)足三里對痛反應(yīng)已無明顯抑制,但電針對側(cè)足三里仍表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng),表明 C纖維在針刺鎮(zhèn)痛中起重要作用。朱麗霞等〔6〕在辣椒素處理的新生大鼠身上觀察到,針刺遠(yuǎn)離疼痛部位穴位的鎮(zhèn)痛作用明顯減弱,針刺疼痛局部的穴位仍有鎮(zhèn)痛作用,表明針刺遠(yuǎn)神經(jīng)節(jié)段穴位的鎮(zhèn)痛作用需要 C纖維的參與。方宗仁等〔7〕研究發(fā)現(xiàn),辣椒素處理骨神經(jīng)后電針足三里和三陰交抑制脊髓背角神經(jīng)元晚成分放電的效應(yīng)明顯減弱。徐嶸等〔8〕也同樣用辣椒素處理大鼠坐骨神經(jīng),發(fā)現(xiàn)電針環(huán)跳穴的鎮(zhèn)痛效應(yīng)作用明顯。因此,傳入 C纖維在針刺鎮(zhèn)痛中有重要作用。但也有學(xué)者對此提出異議。包虹等〔9〕將辣椒素作用于大鼠坐骨神經(jīng) 45min后,觀察到電針足三里和三陰交對脊髓背角廣動力神經(jīng)元的抑制作用無明顯影響,因此認(rèn)為 C纖維不是電針鎮(zhèn)痛的主要傳入纖維,而是彌散傷害抑制性控制(DNIC)的傳入纖維。

筆者的前期研究表明,辣椒素處理支配四白穴的眶下神經(jīng)后,電針?biāo)陌籽ㄕT導(dǎo)三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核Ⅰ～Ⅱ板層的 cfos表達(dá)明顯減弱〔4〕,提示 C纖維可能是四白穴針刺信息的主要傳入途徑。本研究中,在內(nèi)臟痛大鼠身上觀察到辣椒素處理眶下神經(jīng)后,電針?biāo)陌籽ǖ逆?zhèn)痛作用明顯減弱。因此,C纖維在電針口面部穴位鎮(zhèn)痛效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

此外,本研究中還觀察到電針?biāo)陌籽@著抑制內(nèi)臟痛大鼠NTS的c-fos表達(dá),辣椒素處理后此抑制作用也明顯減弱,且PTN的 c-fos表達(dá)亦減弱,提示 NTS和PTN參與電針?biāo)陌籽ǖ逆?zhèn)痛作用。

NTS接受Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ對腦神經(jīng)的一般和特殊的內(nèi)臟傳入纖維,是內(nèi)臟感覺傳入的重要中繼站。來自內(nèi)臟的機械、化學(xué)等多種傷害性刺激主要通過迷走神經(jīng)直接上傳至 NTS〔10,11〕。筆者的前期工作也表明胃擴張和電針口面部穴位均誘導(dǎo)NTS的c-fos表達(dá)〔12〕,細(xì)胞外記錄的結(jié)果進(jìn)一步證實 NTS存在對口面部的軀體刺激和胃擴張的內(nèi)臟刺激同時起反應(yīng)的神經(jīng)元〔13〕。因此,NTS是內(nèi)臟感覺傳入和面口部穴位的軀體感覺傳入?yún)R聚及整合的重要中樞。

PTN主要通過包括眶下神經(jīng)、下牙槽神經(jīng)、咬肌神經(jīng)、耳顳神經(jīng)等接受頭面部的軀體傳入〔14～16〕。PTN與 NTS之間有廣泛的傳出纖維聯(lián)系,PTN投射至 NTS的纖維終末與直接與接受胃腸等內(nèi)臟感覺初級傳入的終末區(qū)在 NTS內(nèi)相互重疊〔17〕。神經(jīng)束路示蹤研究表明,PTN存在著中繼三叉神經(jīng)初級傳入并將之向NTS投射的神經(jīng)元,提示三叉神經(jīng)和NTS之間存在由二級神經(jīng)元組成的傳入通路〔18〕。因此,口面部的軀體感覺傳入通過 C纖維經(jīng)PTN中繼后與內(nèi)臟的感覺傳入在 NTS發(fā)生匯聚并進(jìn)行整合,這可能是電針?biāo)陌籽▽?nèi)臟痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的機制。

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