胃癌組織 PTEN基因的表達及其與 MMP-9的相關性

覃月秋 黃贊松 何守搞 周喜漢

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科,廣西 百色 533000)

與細胞支架蛋白 tensin同源在 10號染色體有缺失的磷酸酯酶(PTEN)是近年發(fā)現(xiàn)的第 1個具有磷酸酶活性的抑癌基因〔1〕。它能通過對酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸脫磷酸化作用調控細胞內多種信號傳導通路,從而調節(jié)細胞的生長、發(fā)育,誘導細胞凋亡,調控細胞周期以及抑制腫瘤細胞黏附、轉移。研究發(fā)現(xiàn),PTEN基因突變、缺失及異常表達與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關〔1～3〕?；|金屬蛋白酶-9(MMP-9)能降解基膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原成分,為惡性腫瘤的浸潤、轉移及腫瘤間質血管的新生提供有利條件〔4〕。關于PTEN基因對轉移相關酶 MMP-9的調節(jié)機制國外已有少量文獻報道。本研究通過檢測抑癌基因PTEN在胃癌中的表達,觀察其與胃癌臨床病理因素的關系及與 MMP-9蛋白表達的相關性,探討 PTEN基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 57例原發(fā)性胃癌及癌旁正常組織取自本院 1999至 2002年經(jīng)病理證實的手術切除標本蠟塊或活檢組織,患者術前均未經(jīng)放療和化療。57例癌組織中,男性 39例,女性 18例,年齡 30～75歲,平均(49±5.35歲)。按分化程度:低分化癌 39例,高分化、中分化癌 18例。癌轉移情況:有淋巴結轉移32例,無淋巴結轉移 25例;遠處轉移 7例,無遠處轉移 50例。胃癌浸潤深度:浸潤未超過漿膜層(T1+T2)22例,浸潤超過漿膜層(T3+T4)35例。TNM分期:Ⅰ期 13例,Ⅱ期 11例,Ⅲ期24例,Ⅳ期 9例。

1.2 方法 每例取原發(fā)灶癌組織、切緣正常組織及轉移淋巴結,組織經(jīng) 10%甲醛固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,分別進行HE染色和免疫組化S-P法染色(操作按試劑盒說明書進行)。鼠抗人 PTEN單克隆抗體及鼠抗人 MMP-9單克隆抗體均為Santa Cruz公司產品。S-P試劑盒購自福州邁新生物公司。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷 PTEN和MMP-9蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,定位于胞漿。在高倍鏡(×400)下每張切片至少 5個隨機視野中計數(shù) 500個細胞,計算陽性細胞數(shù)的百分比。按切片中陽性細胞率及染色反應強度分為 4級:陰性(-):細胞內不著色或陽性細胞率 ＜10%;弱陽性(+):細胞內出現(xiàn)淺棕色顆粒和(或)陽性細胞率為 10%～29%;陽性(?):細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率為 30% ～60%;強陽性(?):細胞內出現(xiàn)深棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率 ＞60%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗及 Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中 PTEN蛋白和 MMP-9蛋白的表達 PTEN蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,位于細胞質。胃癌組織中PTEN蛋白表達的陽性率 61.4%(35/57)顯著低于癌旁正常胃黏膜 100%(57/57)(P＜0.01)。MMP-9蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,位于細胞漿。癌組織 MMP-9蛋白表達的陽性率 73.7%(42/57)明顯高于相應正常組織 19.3%(11/57)(P＜0.01)。

2.2 胃癌中 PTEN和 MMP-9蛋白表達的相關性 胃癌中PTEN蛋白的表達強度與 MMP-9蛋白的表達強度呈負相關(rs=-0.462,P＜0.01),隨著 PTEN蛋白表達強度的增加,MMP-9蛋白表達強度減弱,反之亦然。見表 1。

表1 胃癌組織PTEN和MMP-9蛋白表達的相關性

2.3 胃癌組織PTEN蛋白和 MMP-9蛋白表達與臨床病理特征的關系 TNM分期Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織 PTEN蛋白表達水平低于Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織(P＜0.01);低分化癌組織PTEN蛋白的表達低于高分化、中分化癌組織(P＜0.01);有淋巴結轉移的胃癌組織PTEN蛋白表達低于無淋巴結轉移的胃癌組織(P＜0.05),胃壁浸潤程度越深表達越低。而 MMP-9蛋白表達水平則隨胃壁浸潤深度增加、淋巴結轉移及 TNM分期的進展而增高。見表 2。

表2 胃癌及癌旁正常組織PTEN和MMP-9蛋白的表達

3 討 論

PTEN基因〔1～3〕(又稱 MMAC1或 TEP1)由 3個研究小組于1997年發(fā)現(xiàn)并命名,因該基因在人類多種腫瘤中存在突變、缺失及異常表達,被認為是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的又一重要抑癌基因。PTEN基因定位于 10q23.3,全長約 200 kb,由 9個外顯子和 8個內含子組成。其氨基端(N端)磷酸酶區(qū)域為主要功能區(qū),該區(qū)第 122～133位氨基酸序列內有雙特異性磷酸酶(DSP)催化區(qū)的核心基序 HCXXGXXTS/T,對酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸有脫磷酸化作用,既可通過脂質磷酸酶活性調節(jié)細胞生長和凋亡,也可利用蛋白磷酸酶活性抑制細胞黏附和轉移。

最近的研究證明消化道腫瘤中存在該基因的缺失、突變或異常表達。Tachibana等〔5〕用免疫組化法檢測 97例食管癌,其中 PTEN蛋白陽性表達率 49.5%,陰性表達率 50.5%,且 PTEN表達與腫瘤 TNM分期、患者存活率明顯相關。Yang等〔6〕檢測了胃癌組織及鄰近正常胃黏膜組織、腸化生、不典型增生組織中 PTEN蛋白表達的情況,結果正常胃黏膜組織及腸化生組織中 PTEN蛋白表達的陽性率(分別為 100%、98.5%)明顯高于不典型增生(66.7%)及胃癌組織(47.8%)(P＜0.01)。本研究結果提示,①PTEN蛋白失表達促進了胃癌的發(fā)生、發(fā)展,檢測 PTEN蛋白的表達可作為胃癌發(fā)生的監(jiān)測指標之一。②PTEN蛋白的表達與胃癌的組織分化程度呈正相關:組織分化程度高、惡性程度低者,PTEN蛋白表達的陽性率高;而 PTEN蛋白失表達或弱陽性表達則多見于組織分化程度低、惡性程度高者。③PTEN蛋白的表達隨胃壁浸潤深度增加、淋巴結轉移及TNM分期的進展而降低,說明 PTEN蛋白失表達在胃癌的增殖、浸潤、轉移等過程中起到了促進作用,PTEN蛋白的檢測,有可能為判斷胃癌的惡性程度及患者的預后提供線索。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一種重要的蛋白水解酶。能降解細胞外基質,參與胎兒發(fā)育過程中的組織重構和傷口愈合過程中的膠原重構等生理過程。在病理情況下,MMPs一方面通過降解基底膜和包繞腫瘤的基質,突破基質屏障,促進腫瘤浸潤、轉移,另一方面則通過毛細血管增生,新生血管生成等促進腫瘤生長、擴散〔7〕。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一,可降解細胞外多種基質成分,如Ⅳ型膠原、蛋白多糖、層黏蛋白及纖維連接蛋白等,在腫瘤浸潤、轉移過程中發(fā)揮極其重要的作用〔8,9〕。 Torii等〔10〕檢測了 70例胃癌患者和 130例正常人MMP-9的表達,結果發(fā)現(xiàn)胃癌組織 MMP-9高于正常組織,且與腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度及 TNM分期有關。本研究結果提示胃癌組織中存在 MMP-9的過度激活。與 Torii等〔10〕的研究結果一致。表明胃癌組織分泌MMP-9降解了基底膜和細胞外基質,促進了腫瘤細胞向周圍組織浸潤,是反映胃癌惡性進展的一個比較可靠的指標。

抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移是 PTEN基因的重要生物學功能之一,關于 PTEN基因對轉移相關酶MMP-9的調節(jié)機制國外已有少量文獻報道。Moon等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),轉錄因子 NF-kappaB和活化蛋白-1(AP-1)能調節(jié) MMP-9啟動子的轉錄,而PTEN基因通過抑制 NF-kappaB和 AP-1的作用,使 MMP-9啟動子的轉錄活性顯著降低,MMP-9蛋白合成及表達減少。Park等〔12〕發(fā)現(xiàn),在成膠質瘤細胞系 U87MG、U251MG和 U373MG中,PTEN基因的失活促進透明質酸酶誘導的 MMP-9分泌;而野生型 PTEN表達的成膠質瘤細胞系 LN229、LN18和 LN428中并無類似現(xiàn)象。此外,把野生型 PTEN導入U87MG細胞系后,透明質酸酶誘導的MMP-9分泌顯著減少。這說明,通過阻斷透明質酸酶誘導的 MMP-9分泌而抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移是PTEN基因的作用機制之一。本研究結果說明 PTEN基因低表達或失表達可能導致了 MMP-9的過度激活,促進腫瘤浸潤、轉移。研究兩者的關系有助于闡明PTEN基因的作用機制及胃癌轉移的分子機制,為開辟腫瘤治療新途徑打下理論基礎。

用免疫組化法檢測胃黏膜組織 PTEN基因及 MMP-9的表達簡便、快速,既可為胃癌早期診斷提供線索,又有助于判斷預后。在治療上,對患者給予化學干預治療,促進 PTEN基因表達,抑制MMP-9表達,有可能阻斷或逆轉癌前病變,抑制胃癌轉移,降低患者死亡率,這將為胃癌治療提供極富吸引力的前景。

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2 Steck PA,Pershouse MA,Jasser SA,et al.Identification of a candidate tumour suppressor geng,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers〔J〕.Nat Genet,1997;15:356-2.

3 Li DM,Sun H.TEP1,encoded by a candidate tumor suppressor locus,is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor β〔J〕.Cancer Res,1997;57:2124-9.

4 Cornelius LA,Nehring LC,Roby JD,et al.Human dermal microvascular endothelial cells produce matrix metalloproteinases in response to angiogenic factors and migration〔J〕.J Invest Dermatol,1995;105(2):170-6.

5 Tachibana M,Shibakita M,Ohno S,et al.Expression and prognostic significance of PTEN product protein in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer,2002;94(7):1955-60.

6 Yang L,Kuang LG,Zheng HC,et al.PTENencoding product:a marker for tumorigenesis and progression of gastric carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol,2003;9(1):35-9.

7 Kleiner DE,Stetler-Stevenson WG.Matrix metalloproteinases and metastasis〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,1999;43(suppl):S42.

8 Aznavoorian S,Murphy AN,Stetler-Stevenson WG,et al.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis〔J〕.Cancer,1993;71(4):1368-83.

9 Ramos-DeSimone N,Hahn-Dantona E,Sipley J,et al.Activation of matrix metal lipoproteinase-9(MMP-9)via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion〔J〕.J Biol Chem,1999;274(19):13066-76.

10 Torii A,Kodera Y,Uesaka K,et al.Plasma concentration of matrix metallipoproteinase 9 in gastric cancer〔J〕.Br J Surg,1997;84(1):133-6.

11 Moon SK,Kim HM,Kim CH.PTEN induces G1 cell cycle arrest and inhibits MMP-9 expression via the regulation of NF-kappaB and AP-1 in vascular smooth muscle cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,2004;421(2):267-76.

12 Park MJ,Kim MS,Park IC,et al.PTEN suppresses hyaluronic acid-induced matrix metalloproteinase-9 expression in U87MG glioblastoma cells through focal adhesion kinase dephosphorylation〔J〕.Cancer Res,2002;62(21):6318-22.