液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)中藥制劑中西地那非的測(cè)定

杜書君 唐斌斌 高海

（1陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院，山東 陽(yáng)谷 252300；2陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710000）

枸櫞酸西地那非是治療男性勃起功能不良的一種藥物。自1997年3月由美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市以來,該藥因其療效確切，至2000年上半年，全球已有100多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)使用。但在使用過程中發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致臥位低血壓,尤以同時(shí)服用硝酸酯類或含硝酸根的藥物更為明顯，嚴(yán)重者可引起心肌梗死甚至死亡[1]。美國(guó)心臟病學(xué)院和美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)已明確指出,24 h內(nèi)使用過硝酸酯類藥物者禁用西地那非。我國(guó)也對(duì)西地那非的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)及使用進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。然而，目前在補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中藥制劑和保健食品中違法添加枸櫞酸西地那非的情況甚為嚴(yán)重。為有效打擊這種不法行為，建立一套方便可行的中藥保健品中西地那非成分測(cè)定方法是非常有必要的。

圖1 西地那非對(duì)照品和樣品的全離子掃描圖

1 材料

1.1 儀器

Quattro Micro API系統(tǒng)液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括ESI（電噴霧電離）源，Waters6890液相色譜儀，Waters公司Massl-ynx 4.1質(zhì)譜解析工作站。

1.2 試藥

西地那非對(duì)照品（純度≥99%，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，110857-200608）；西地那非供試品：鎖陽(yáng)固精丸（批號(hào)：060505，060508，060511），甲醇（色譜純，山東禹王公司）；乙腈（色譜純，廣州飛獅化工有限公司）；水為高純水，其他試劑均為分析純。

圖2 西地那非對(duì)照品和樣品的子離子掃描圖

2 方法與結(jié)果

2.1 西地那非對(duì)照品溶液的制備

精密稱取西地那非對(duì)照品5.01 mg，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相超聲溶解然后定容至刻度。配制成含西地那非50 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取該儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，制成濃度為 1，2，3，4，5 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品一丸，稱重，再將其粉碎成小顆粒，精密稱重。置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解至無大顆粒狀物質(zhì)，加流動(dòng)相定容至刻度，混勻，放置過夜。經(jīng)過沉淀后取上層溶液適量，10 000 r/min，離心10 min，上清液過微孔濾膜，濾液用流動(dòng)相稀釋100倍，即得。

2.3 測(cè)定條件

2.3.1色譜條件C18色譜柱（2.1×100 mm，3.5 μm）流動(dòng)相：0.01 mol/L，乙酸銨∶乙腈∶甲醇（55∶10∶35），流速 0.2 mL/min,柱溫 30℃，進(jìn)樣量 1 μL。

2.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），掃描范圍：m/z 100～1 000,毛細(xì)管電壓3 KV，錐孔電壓：40 V，離子源溫度：110 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，脫溶劑氣體：450 L/hr，錐孔氣：50 L/hr，自動(dòng)進(jìn)樣器直接進(jìn)樣，負(fù)離子方式檢測(cè)。通過Full Scan，SIR，Daughter對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在鎖陽(yáng)固精丸中檢測(cè)出西地那非。根據(jù)樣品SIR圖中色譜峰的峰面積與對(duì)照品的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算西地那非的摻入量。西地那非對(duì)照品和樣品的全離子掃描、子離子掃描以及碎片離子掃描圖，分別見圖1，圖2，圖3。

圖3 西地那非對(duì)照品和樣品的碎片離子掃描圖

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系

將“2.1”項(xiàng)下的系列對(duì)照品分別進(jìn)樣1 μL，每一濃度做3次平行實(shí)驗(yàn)。以對(duì)照品濃度X為橫軸，色譜峰面積Y為縱軸進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：

Y＝3 344 085X－3 805.19 r＝0.999 7結(jié)果表明西地那非濃度在1～5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn)

將濃度為3 μg/mL的對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為1 μL，西地那非峰面積RSD為1.26%（n＝5）。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將“2.2”項(xiàng)的供試品分別在 0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，測(cè)定西地那非的峰面積，其峰面積的RSD為1.2%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一批樣品分別取樣5份，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶液制備，在上述測(cè)定條件下進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果測(cè)得該批樣品的西地那非含量為1.37%，RSD為1.3%（n＝5）。

3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品9份，每份50 mg，分別加入50 μg/mL 的對(duì)照品溶液 10，15，20 mL，每種濃度各 3 份，按“2.2”項(xiàng)下制備溶液，各進(jìn)樣1 μL，3個(gè)濃度的平均回收率分別為103%，105%，98%，RSD分別為1.61%，1.76%，1.49%。

3.6 樣品測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)的樣品，采用的對(duì)照品溶液參見“2.1”項(xiàng)，按“2.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液。進(jìn)樣1 μL，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中西地那非的含量，結(jié)果3批樣品中西地那非含量（n=3）分別為 1.32%，1.36%，1.48%，RSD分別為1.98%，1.86%，1.75%。

4 結(jié)果與討論

中藥制劑及保健品中擅自添加枸櫞酸西地那非等物質(zhì)，日常多使用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。然而僅從TLC、HPLC法的保留時(shí)間一致上還不能充分肯定樣品中是否含有西地那非，需要通過液質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)一步確認(rèn)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，若供試品HPLC色譜峰保留時(shí)間與西地那非對(duì)照品色譜峰一致，并且供試品該色譜峰液質(zhì)聯(lián)用的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜均與相應(yīng)西地那非對(duì)照品一致，則可認(rèn)為供試品中含有西地那非[2]，故日常檢測(cè)工作中往往在使用TLC和HPLC進(jìn)行保留時(shí)間定性后還需進(jìn)一步使用質(zhì)譜對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行最終的明確。本文采用日益廣泛使用的液質(zhì)聯(lián)用儀器，同時(shí)完成了樣品中違禁成分西地那非的定性和定量分析，該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可作為中成藥、保健品質(zhì)量控制的有效方法。

[1]遲丹怡.西地那非的不良反應(yīng)[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2003，5(5)：352-354.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].2000.