應(yīng)用 RAPD技術(shù)對我國不同地域紅色毛癬菌分離株的遺傳多樣性研究

魯莎 魯長明 吳紹熙 李春陽 沈永年 李希清

(1.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科,廣州 510120;2.中國科學(xué)院皮膚病研究所,南京 210042;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科,濟南 250062)

紅色毛癬菌是皮膚癬菌病中最常見的致病菌之一,常引起人體局部或泛發(fā)性感染。其在培養(yǎng)基上表型包括絨毛狀、粉末狀等,但表型變異易受多種因素 (如生長環(huán)境、多次傳代等影響而不穩(wěn)定)。而基因型較表型穩(wěn)定,因此用基因分型方法進行流行病學(xué)研究具有優(yōu)勢。目前分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原真菌的分型、鑒定及同源性研究[1-3]。其中,隨機擴增 DNA多態(tài)性 (Random amplified polymorphicDNA,RAPD)方法具有快速、靈敏等優(yōu)點,近年的一些研究也證實了其在分子流行病學(xué)研究等方面的應(yīng)用價值。本實驗采用該方法對來源于我國不同地域 (江蘇南京、山東濟南、廣東廣州),分別代表我國華東、中南及華南的 32株紅色毛癬菌臨床分離株進行了 DNA多態(tài)性分析,試圖探討 DNA型別與地域、表型及感染部位等之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

菌株來源 共收集臨床分離的紅色毛癬菌 32株 (見表 1),分別來自山東濟南 8株,江蘇南京 12株,廣東廣州 12株。其中男性 23例,女性 9例,平均年齡約 35歲。21株菌分離自足部,3株菌分離自軀干,7株菌分離自股部,1株菌分離自手指甲。

表 1 32株紅色毛癬菌臨床分離株的一般資料及RAPD分型Tab.1 General information and RAPD typing of the 32clinical isolates of Trichophyton rubrum

菌株培養(yǎng)與鑒定 以點接種法接種實驗菌株于沙氏瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)中,27℃培養(yǎng) 10 d后觀察菌落形態(tài),并按菌落質(zhì)地將表型大致分為絨毛狀及粉末狀;所有菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA),27℃溫箱孵育 10d后觀察色素生成情況;使用玻片法制作小培養(yǎng)以鑒定鏡下形態(tài);如PDA培養(yǎng)后無紅色色素生成,通過 rDNA ITS序列分析以進一步鑒定。

1.2 菌株 DNA提取

將鑒定后菌株轉(zhuǎn)種于 SDA,27℃培養(yǎng) 10 d,參照文獻方法[4],液氮研磨后使用抽提緩沖液 InSta-GeneTMMatrix(BIO-RAD,美國)提取提取菌株DNA,經(jīng)紫外分光光度計測量 OD260、OD280及計算 OD260/OD280比值,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RAPD分析

選取 Kim等[5]報道的用于紅色毛癬菌基因分型的 3個隨機引物 (ATGS,5'-ATGGATCSSC-3'、OPAO-15,5'-GAAGGCTCCC-3'、UBC-701,5'-CCCAACAACCC-3'),分別對 32株臨床分離株進行 RAPD分析。PCR總反應(yīng)體系為 50μL:5μL模板 DNA(20～50 ng),4μL dNTP混合物 (2.5 mM,Nippon Gene,Japan),25 pmol引物,1.25 U Taq多聚酶 (5 U/μL,Nippon Gene,Japan),5μL 10×反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene,Japan),加 ddH2O到 50μL。擴增反應(yīng)程序為 94℃預(yù)變性 2 min,94℃變性 1 min,34℃復(fù)性 1 min,72℃延伸 2 min,40個循環(huán),最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠 (含 0.5 μg/μL溴化乙錠)100 V,90 min電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。圖片用 GelCompar software,version 4.0(Applied Maths,Kortrijk,Belgium)進行修整,計算 Jaccard遺傳相似系數(shù),并用 Ward法進行聚類分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[6]。

2 結(jié) 果

2.1 實驗菌株表型分型及鑒定

32株臨床分離株經(jīng)培養(yǎng) 10 d后,菌落直徑約5 cm菌落,其中分別有 19株菌和13株菌菌落質(zhì)地呈絨毛狀和粉末狀表型。小培養(yǎng)鏡下形態(tài)為典型的淚滴型至棒狀小分生孢子。G8、G11經(jīng) PDA培養(yǎng)后無紅色色素生成,經(jīng)擴增 rDNA的 ITS區(qū)后獲得 DNA序列,并通過 GenBank核酸序列庫 (http://www.ncbi.nlm.nih/blast)進行序列比對進行分子生物學(xué)方法鑒定。32株臨床分離株經(jīng)形態(tài)學(xué)和 rDNA ITS序列分析后均鑒定為紅色毛癬菌。

2.2 RAPD分析

圖 1 經(jīng)引物 OPAO-15擴增的 RAPD結(jié)果:M.Marker(100 bp DNA ladder,Takara) 圖 2 聚類分析樹狀圖Fig.1 RAPD patterns of primer OPAO-15 Fig.2 Dendritic map of cluster analysis

3個引物分別擴增后,引物 OPAO-15產(chǎn)生的譜型清晰,且能產(chǎn)生多態(tài)性條帶,利于進行多態(tài)性分析,選擇其為此次分析的引物。經(jīng)兩次重復(fù)后顯示引物OPAO-15擴增DNA片段的分子量在200～1500bp間 ,擴增條帶約 5-11條 (見圖 1)。按其同源性分為三大聚類群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,見圖 2),不同地域分離株分布在不同群中。群Ⅰ包括 12株菌,有 7條主要 DNA片段,分別包括廣州 5株,南京 5株及濟南 2株。Ⅱ群包括 9株菌,有 7條主要 DNA片段,分別包括廣州 3株,南京 3株及濟南 3株。Ⅲ群包括 11株菌,有 6條主要 DNA片段,分別包括廣州 4株,南京 4株及濟南 3株。

此外,不同表型的菌株分布在不同群中。絨毛狀菌株中有 9株 (占總數(shù)的 47%)分布在Ⅰ群中。粉末狀菌株中有 7株 (54%)分布在Ⅲ群中,也顯示有較高同源性。

再次,不同患者在同一取材部位分離菌株DNA型可不同。如表 1所示,分離自軀干的 3株菌分布在Ⅱ和Ⅲ群中;分離自股部的 7株菌主要分布在Ⅰ群中;來源于足部感染的 21菌株表現(xiàn)出多種基因型,平均分布于三個群中。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,近年來已將多種分子生物學(xué)技術(shù)用于真菌感染流行病學(xué)、真菌基因多態(tài)性及種系發(fā)生關(guān)系等的研究,可直接從 DNA水平反映基因本身,對真菌分類鑒定的研究起重要作用。而基因分型方法有助于了解致病菌種間及種內(nèi)差異,有效獲得致病菌分類、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及有性/無性繁殖關(guān)系等信息,已廣泛應(yīng)用于多種皮膚癬菌的遺傳多態(tài)性研究,也陸續(xù)有關(guān)于紅色毛癬菌相關(guān)研究的報道[7-9]。

我們研究發(fā)現(xiàn),來源于三個地域的 32株紅色毛癬菌種內(nèi)差異較大,根據(jù)遺傳相似性分成三大聚類群,不同地域來源菌株的基因分型分布于三大聚類群中,與成曉茹等[10]研究結(jié)果相似,未能體現(xiàn)環(huán)境因素對遺傳特征的影響。而不同地域來源的菌株可具有相同或相似的基因型,如 N11與G10(分別來源于南京及廣州),提示隨著人口流動的增加,地域間菌株基因型差異減小,地域內(nèi)菌株多樣性增加。

多項研究表明,同一部位的紅色毛癬菌感染可由不同基因型的菌株引起,且同一感染部位可在感染的不同時期分離出基因型不同的紅色毛癬菌株,提示感染可能由不同基因型菌株混合感染引起,并可能與病情的發(fā)展相關(guān),進而影響治療效果,同時對復(fù)發(fā)和再感染的判斷有一定提示作用。而我們實驗菌株的 RAPD帶型與取材部位之間未發(fā)現(xiàn)明顯的對應(yīng)關(guān)系,不同患者同一取材部位的菌株DNA型可相同,無明顯特異性,與陳輝、鐘志紅等[11,12]研究結(jié)果相似。而基因型與表型存在一定相關(guān)性,研究發(fā)現(xiàn),各表型約一半或以上集中于一個聚類群中,提示同一表型較不同表型間菌株同源性高,具有不同遺傳特征的菌株在一些生長環(huán)境等因素影響下及傳代過程中,菌株可發(fā)生表型特征的改變,表型結(jié)合基因型進行分析有利于進行流行病學(xué)調(diào)查研究。

研究結(jié)果表明,RAPD為病原真菌的生物學(xué)特性研究提供可能,在流行病學(xué)研究方面具有一定價值。另一方面,RAPD存在一定弱點,如可受不同引物、模板濃度、反應(yīng)條件等因素影響,不同地域間研究存在差異,因此,大樣本及多種分析方法的運用更能完善及推動分子流行病學(xué)的發(fā)展。

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