幾種不同基質(zhì)對阿薩希毛孢子菌形成生物膜影響的初步觀察

任曉萍 樊昕 楊蓉婭 夏志寬 李海濤

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心,北京 100125;2.運城市中心醫(yī)院,山西 044000)

阿薩希毛孢子菌 (T.asahii)在自然界中廣泛存在,是毛孢子菌屬中最重要的臨床致病菌,可導(dǎo)致播散性毛孢子菌病及夏季超敏性肺炎。調(diào)查發(fā)現(xiàn),毛孢子菌已成為僅次于隱球菌和釀酒酵母的第三位常見的非白念株菌酵母[1,2]。與浮游狀態(tài)相比,阿薩希毛孢子菌生物膜細(xì)胞對抗真菌藥物的耐藥性明顯增加[3,4]。生物膜被定義為微生物聚集在一起,由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹的菌細(xì)胞群體,不僅可在自然界產(chǎn)生,也可在宿主體內(nèi)產(chǎn)生,是微生物的一種獨特的生存方式[5]。生物膜導(dǎo)致耐藥性增加的機制目前尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)很多因素可以影響真菌生物膜的形成,如物理性質(zhì):基質(zhì),碳源,唾液的存在,氧氣的存在,表面限定,酸堿環(huán)境;環(huán)境因素:熱,冷,紫外線;真菌的種類[5]。成熟真菌生物膜的結(jié)構(gòu)主要受附著層表面材料的影響[6]。本實驗以聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯為生物膜黏附基質(zhì)觀察不同基質(zhì)對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響,為臨床醫(yī)用材料的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 阿薩希毛孢子菌株 1株,來源于本院皮膚科臨床分離株 (BZP07002),并經(jīng) API20AUX生化鑒定及 DNA序列分析驗證 (AS2.2174)[7]。

主要試劑及材料 XTT試劑:AppliChem公司,PMS:Sigma公司,掃描電鏡:HITACHI S-520,由北京市神經(jīng)外科研究所提供。

1.2 方法

生物膜體外構(gòu)建[3]將-80℃保存的阿薩希毛孢子菌菌種復(fù)蘇,在沙氏培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)種培養(yǎng) 2次,轉(zhuǎn)入酵母蛋白胨葡萄糖肉湯 (YPD)中過夜振蕩培養(yǎng),離心、收集后,重懸于 RPMI-1640中,稀釋成106CFU∕ mL菌懸液。在培養(yǎng)板中預(yù)先放入無菌的聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯 (長寬各為 1.0 cm),每種材料共 9個,分 3個孔放入。將 2.0 mL該菌懸液加入到 24孔培養(yǎng)板中,28℃培養(yǎng) 72 h。2 h時 PBS緩沖液沖洗2次,重新加入 2.0 mL RPMI-1640培養(yǎng)液。之后每隔 24 h更換一次培養(yǎng)液。設(shè)不加有阿薩希毛孢子菌的空白對照組。

生物膜形成的定量分析[3]通過 XTT還原比色測定法進(jìn)行定量分析。測定依據(jù)通過代謝活性細(xì)胞使黃色的四唑鹽 XTT分裂成橘黃色的甲臜染料。RPMI-1640培養(yǎng)液中加入 XTT和電子耦合劑PMS使終濃度為 12.5μmol/L。在預(yù)先洗滌培養(yǎng)0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h的生物膜孔63個 (每組 3孔,每孔 3個,共 7組)和空白對照孔中放入 1.5 mL的 XTT-PMS溶液,28℃避光培養(yǎng) 2 h。離心上清液平分在 96孔板中,微量滴定板 492 nm下讀數(shù)。

倒置顯微鏡觀察 將培養(yǎng) 2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h的含生物膜的聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯用滅菌的 PBS緩沖液沖洗2次,放置在載玻片上倒置顯微鏡下觀察。

掃描電鏡觀察 選培養(yǎng) 48 h的含生物膜的聚芳脂、聚苯乙烯材料常規(guī)掃描電鏡制片并觀察其形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。采用單因素方差分析 (F)和 LSD-t檢驗進(jìn)行多個樣本均數(shù)的兩兩比較。取 α=0.01為檢驗水準(zhǔn),P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株在體外生物膜的形成及定量測定

表 1顯示 3種材料在 1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h各時間點上形成生物膜的活力,隨時間延長,生物膜的活力逐漸增強。對成熟期 48 h的生物膜活性采用方差分析表明不同材料上形成阿薩希毛孢子菌生物膜的活性有差別 (F=14.743,P<0.01,見表 2),采用 LSD-t檢驗進(jìn)行多個樣本均數(shù)的兩兩比較,聚芳脂與聚氯乙烯的活性差別無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.01),其余材料兩兩比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)。說明不同材料上形成生物膜的活性有差別,活性由高到低為聚芳脂材料 =聚氯乙烯材料 >聚苯乙烯材料。

2.2 倒置顯微鏡下形態(tài)

實驗發(fā)現(xiàn)材料聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯在2 h時均有微生物黏附,隨時間延長,生物膜形成逐漸增多,經(jīng)歷黏附期,形成期和成熟期。且其形成的生物膜廣泛,覆蓋整個材料。觀察發(fā)現(xiàn)聚芳脂、聚氯乙烯形成的生物膜可見孢子、菌絲、假菌絲結(jié)構(gòu),聚苯乙烯上形成以孢子為主要結(jié)構(gòu)的微生物群落 (見圖 1～3)。

表 1 阿薩希毛孢子菌在 3種材料上形成生物膜的定量 XTT值測定 ( x±s)Tab.1 Analysis of the activity of T.asahiibiofilm by XTT on 3 kind of support materials( x±s)

表2 不同材料上 48h阿薩希毛孢子菌生物膜活性方差分析結(jié)果Tab.2Analysisof the activityof T.asahiibiofilm on 3kind of support materials

2.3 掃描電鏡下形態(tài)

觀察在聚芳脂、聚苯乙烯材料表面培養(yǎng) 48h的阿薩希毛孢子菌生物膜在掃描電鏡下的結(jié)構(gòu),放大倍數(shù)分別為 ×2 000,×5 000。聚芳脂掃描電鏡下可見生物膜為多層結(jié)構(gòu),包括所有真菌形態(tài) (關(guān)節(jié)孢子、假菌絲、菌絲),形成一個復(fù)雜的三維立體架構(gòu)。鏡下可見串珠狀孢子,關(guān)節(jié)孢子,部分孢子上可看到絨毛狀結(jié)構(gòu)(見圖4)。聚苯乙烯表面生物膜在掃描電鏡下觀察為一個個的形態(tài)不規(guī)則的孢子。未見菌絲和假菌絲 (見圖 5)。

圖 1～3 分別示聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯 3種材料上倒置顯微鏡下 T.asahii生物膜的形態(tài) (a.2 h,b.48 h,c.72 h;×200)。2 h時為散在的芽生孢子結(jié)構(gòu);48 h時孢子、菌絲、假菌絲結(jié)構(gòu)相互纏繞聚集,并被胞外多糖基質(zhì)包繞。1c,3c可見孢子、菌絲、假菌絲結(jié)構(gòu);2c鏡下主要為孢子結(jié)構(gòu)。3種材料鏡下形成的生物膜均很廣泛 圖 4 聚芳脂上 48 h時掃描電鏡下阿薩希毛孢子菌生物膜形態(tài),可見菌絲、關(guān)節(jié)孢子、串珠狀孢子,部分孢子上可看到絨毛狀結(jié)構(gòu) (a.×2 000;b,c.×5 000)Fig.1-3 Morphological characteristics of T.asahiiobserved under inverted microscope on 3 different support materials:PAT,polystyrene and PVC(a.2h,b.48h,c.72h;×200).After 2hours,adherent buddingyeast cells stuck tothematerials in arandommanner.During the maturation phase(48to 72 h),thecomplexity of the biofilmincreased froma monolayer intoa multilayered-structure,involving all fungal morphology(yeast cells,hyphae,and pseudohyphae).1c,3c.yeast cells,hyphae,and pseudohyphae;2c.yeast cells.Widespreading bioform was observed on 3 kind of material Fig.4 Morphological characteristics of T.asahiibiofilm under scanning electron microscope on PAT:hyphae,arthrospore,bead-like spore,villiform structure(a.×2 000;b,c.×5 000)

圖 5 聚苯乙烯上 48 h時掃描電鏡下阿薩希毛孢子菌生物膜形態(tài),只見孢子結(jié)構(gòu) (a.×2 000,b.×5 000)Fig.5 Morphological characteristics of T.asahiibiofilm under scanning electron microscopeon polystyrene:spore only(a.×2 000,b.×5 000)

3 討 論

播散性毛孢子菌病呈世界性分布,是一種慢性、頑固、難治的系統(tǒng)性真菌病,其發(fā)病呈逐年上升的趨勢[8],T.asahii是引起該病的重要致病菌。在對 T.asahii所致播散性毛孢子菌病的臨床研究中發(fā)現(xiàn),盡管使用抗真菌藥物,但感染仍持續(xù)存在。2006年 Giovanni[3]等發(fā)現(xiàn)與浮游狀態(tài)的菌株相比,T.asahii生物膜細(xì)胞對兩性霉素 B、卡泊芬凈、伏立康唑和氟康唑的最低抑菌濃度 (MICs)明顯增加,國內(nèi)李繼紅[4]等也發(fā)現(xiàn)固著相即生物膜細(xì)胞的MIC比浮游相成倍提高。近年來各種醫(yī)用材料(各種支架、導(dǎo)管、瓣膜、起搏器、人工關(guān)節(jié)等材料)的使用率很高,而微生物易于黏附于其表面且可形成生物膜,導(dǎo)致耐藥性增加而感染灶不易清除[9]。Giovanni[8]首先在體外聚苯乙烯材料表面成功構(gòu)建T.asahii生物膜,證明 T.asahii生物膜的存在。研究表明[10],微生物的致病力與其在聚合材料表面形成生物膜的能力呈正相關(guān)。

本實驗以醫(yī)學(xué)上常用的各種導(dǎo)管材料聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯為黏附基質(zhì),觀察不同支撐材料對阿薩希毛孢子菌形成生物膜的影響。研究發(fā)現(xiàn)塑料材料 (聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯)上生物膜形成經(jīng)歷真菌表面黏附、微菌落形成和生物膜成熟的典型步驟,且 3種材料的生物膜黏附時間、聚集及形成復(fù)雜三維立體結(jié)構(gòu)的時間接近,且形成的生物膜結(jié)構(gòu)均為廣泛性的;采用 XTT比色法觀察生物膜活性時發(fā)現(xiàn)生物膜中阿薩希毛孢子菌的活性隨培養(yǎng)時間延長而增加,當(dāng)生長趨于成熟時,代謝的活性相對穩(wěn)定,但仍保持在一個高水平,這表明即使是在成熟的生物膜中,細(xì)胞的數(shù)量也有增加,處于一態(tài)平衡中,這與熒光顯微鏡下觀察結(jié)果一致[11]:在初始階段,有散在的阿薩希毛孢子菌黏附在支撐材料上,其中有少量的死菌,隨時間延長,阿薩希毛孢子菌逐漸聚集成團塊,活菌和死菌的量都增加。研究表明,基質(zhì)的生理化學(xué)特點可影響真菌的黏附從而影響生物膜的形成。不同導(dǎo)管材料上形成的真菌生物膜量亦不同。本實驗發(fā)現(xiàn)在聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯上均能形成生物膜,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)聚芳脂、聚氯乙烯形成的生物膜可見孢子、菌絲、假菌絲結(jié)構(gòu),聚苯乙烯上形成以孢子為主要結(jié)構(gòu)的微生物群落。掃描電鏡下更清楚的發(fā)現(xiàn)微生物群落組成的差異。分析 XTT比色測定的定量結(jié)果可推測菌絲、假菌絲的活力比孢子的活力強。

本實驗表明不同材料上形成阿薩希毛孢子菌生物膜的能力不同,聚芳脂、聚氯乙烯比聚苯乙烯更易于真菌的黏附;且證實了以菌絲、假菌絲為主要結(jié)構(gòu)的微生物群落活力比單純孢子的活力強。針對醫(yī)學(xué)材料上形成生物膜導(dǎo)致抗真菌藥耐藥性增加,研究人員提出了許多干預(yù)措施:Chandra[12]發(fā)現(xiàn) 6%的聚氧化乙烯修飾的聚醚氨基甲酸乙酯比同類未修飾的材料以及其他種類的材料形成白色念珠菌生物膜的能力降低。國內(nèi)馬榮華[13]等發(fā)現(xiàn)納米銀水凝膠涂膜可有效減少氣管導(dǎo)管表面銅綠假單胞菌的黏附數(shù)量,延緩導(dǎo)管表面細(xì)菌生物膜形成,其作用強弱隨培養(yǎng)時間及單位面積中的納米銀劑量的變化而變化。提示對常用的醫(yī)學(xué)生物材料的改良和特殊處理在防治微生物生物膜感染上具有很好的前景。本實驗不足之處是未對阿薩希毛孢子菌生物膜進(jìn)行藥敏試驗。

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