IGF-1在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的作用

孫秀華，胡海洋，張洪開，解智慧，于愛鳴

（中國醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

肺癌是目前世界上死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率仍在逐年上升［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子 1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡的作用［2］。本研究通過在肺腫瘤細(xì)胞中加入不同濃度外源性IGF-1后，觀察細(xì)胞周期、增殖變化，探討IGF-1對人非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）A549、LK2、H460 細(xì)胞系增殖的影響及可能存在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌A549、鱗癌LK2、大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，IGF-1購自PeproTech公司，以DMSO溶解，SKP2抗體購自Bioworld公司，CDC20 同源蛋白 1（CDC20 homolog1，CDH1）抗體購自Santa Cruz公司，MTT、PI購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：H460細(xì)胞系用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，A549、LK2細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，均置于飽和濕度，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測IGF-1對細(xì)胞增殖的影響：取單細(xì)胞懸液，以4×103/孔細(xì)胞接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h，細(xì)胞分為處理組和對照組，處理組分別給 0.1，1，10，100 ng/ml的 IGF-1，以 DMSO組為對照組，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入20μlMTT溶液，37℃孵育4 h，DMSO振蕩溶解，選擇490 nm為吸收波長，酶標(biāo)儀測各孔吸光度。增值率=（A實(shí)驗(yàn)組-A對照組）/A對照組×100%

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞周期：細(xì)胞接種于6孔板，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后（細(xì)胞匯合度為60%左右）血清饑餓24 h，按上述分組，處理組加1 ng/ml IGF-1，對照組加等量DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，取單細(xì)胞懸液，70%乙醇溶液冰上固定2 h，PBS洗滌2次，加入PI染液（50 μg/ml PI，1 mg/mlRNase），室溫，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞中SKP2和CDH1的蛋白表達(dá)：細(xì)胞接種于6孔板，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后（細(xì)胞匯合度為60%左右），血清饑餓24 h，按上述分組，處理組加1 ng/ml IGF-1，對照組加等量DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加裂解液冰上裂解30 min，超聲破碎，4℃，12 000 r/min離心10 min后取上清，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，調(diào)整樣品濃度使其相同，蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗過夜，經(jīng)洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯影并掃描測灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以x±s表示，均值比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1在非小細(xì)胞肺癌 A549、LK2、H460細(xì)胞增殖中的作用

MTT 結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1，1，10，100 ng/ml IGF-1均顯示有促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549、LK2、H460細(xì)胞增殖的作用（P<0.05），其中，1 ng/ml IGF-1作用后細(xì)胞增殖率達(dá)到峰值，10，100 ng/ml時(shí)細(xì)胞增殖率下降，見表1。

表1 不同濃度IGF-1對A549、LK2、H460細(xì)胞增殖影響（x±s）Tab.1 The effect of IGF-1 on the proliferation of A549，LK2 and H460 cells（x ±s）

2.2 IGF-1對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

FCM結(jié)果顯示，與對照組相比，非小細(xì)胞肺癌A549、LK2、H460 3種處理組細(xì)胞S期細(xì)胞均明顯增加（A549：t=31.29；LK2：t=26.88；H460：t=72.67），而 G1期細(xì)胞則較對照組減少（A549：t=19.76；LK2：t=50.77；H460：t=31.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明 IGF-1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌 A549、LK2、H460細(xì)胞G1/S期進(jìn)程，見圖1。

表2 IGF-1處理前后A549、LK2、H460細(xì)胞中SKP2、CDH1蛋白表達(dá)Tab.2 The expression of SKP2 and CDH1 protein in A549，LK2 and H460 cells treated with IGF-1

2.3 IGF-1對SKP2蛋白、CDH1蛋白表達(dá)影響

生長至60%匯合度的細(xì)胞經(jīng)IGF-1處理24 h后，與對照組相比，處理組SKP2蛋白表達(dá)明顯增加（A549：t=5.789；LK2：t=6.0859，H460：t=7.349），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CDH1蛋白無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2、表2。

3 討論

細(xì)胞的過度增殖是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要原因。因此，研究腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制對于研制抗癌藥物、抑制腫瘤發(fā)展、提高患者生存率是至關(guān)重要的。IGF-1是胰島素樣生長因子家族中的成員，其分子結(jié)構(gòu)與胰島素相似，是一個(gè)非糖基化的、由70個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，是一種細(xì)胞增殖調(diào)控因子，已被證實(shí)為腫瘤細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)劑。然而，IGF-1對肺癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制的研究報(bào)道較少，尚未取得一致性結(jié)論［3］。

SKP2是SCF型泛素連接酶的靶蛋白識(shí)別組分，主要識(shí)別包括p27、p21等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，被認(rèn)為是癌蛋白，目前已成為分子腫瘤學(xué)研究中的熱點(diǎn)［4］。

本研究采用MTT法檢測不同濃度IGF-1對NSCLC細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖率增加并非完全呈劑量依賴性，1 ng/ml IGF-1作用最強(qiáng)，細(xì)胞增殖率最大，10 ng/ml IGF-1作用時(shí)，細(xì)胞增殖率下降，100 ng/ml IGF-1作用時(shí)，細(xì)胞增殖率趨于恒定。IGF-1的促增殖作用以及IGF-1與IGF-1受體結(jié)合的有效性受胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGF-binding protein，IGFBP）的調(diào)節(jié)，因此，IGF-1 的作用效果不僅與其自身表達(dá)有關(guān)，而且還與IGF-1受體以及IGFBP的表達(dá)和活性有關(guān)，IGFBP通過改變其自身與IGF-1的親和力，來調(diào)節(jié)IGF-1與IGF-1受體結(jié)合的數(shù)量，從而影響著IGF-1的作用效果［5］。高濃度IGF-1引起細(xì)胞增殖率的下降可能與IGF-1受體的降調(diào)節(jié)、IGFBP的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IGF-1處理的肺癌細(xì)胞表現(xiàn)為S期細(xì)胞明顯增多，而G1期細(xì)胞減少，提示IGF-1可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞快速增殖及惡性發(fā)展。

Western blot結(jié)果顯示3種肺癌細(xì)胞SKP2蛋白表達(dá)水平均明顯升高。IGF-1與IGF-1受體結(jié)合后，激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞生長增殖和存活。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K抑制劑LY294002可通過SKP2-p27軸抑制PI3K/Akt信號(hào)通路［6］。因此可以認(rèn)為，IGF-1通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加SKP2蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而減弱p27、p21的細(xì)胞周期的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，作為調(diào)控細(xì)胞周期的主要泛素連接酶E3 APC/CDH1能夠作用于SKP2蛋白，將其泛素化并經(jīng)由蛋白酶體降解，使細(xì)胞停留在G1期，防止未成熟細(xì)胞過早進(jìn)入 S 期［7］。Fujita等［8］在乳腺癌細(xì)胞的研究中證實(shí)，敲除CDH1基因能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長，并且CDH1是通過Skp2-p27軸調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Liu等［9］根據(jù)在胃腸道腫瘤中的相關(guān)研究結(jié)果也作了類似報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中加入IGF-1后，CDH1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化。因此，可推測IGF-1介導(dǎo)的SKP2蛋白表達(dá)水平增加似乎與CDH1蛋白由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位有關(guān)，其確切的分子機(jī)制有待于今后進(jìn)一步深入研究。

綜上，在 IGF-1 的作用下，A549、LK2、H460 3 種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的SKP2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，S期細(xì)胞明顯增多，而CDH1蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF-1主要通過促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，參與肺癌的發(fā)生與發(fā)展。隨著有關(guān)肺癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的廣泛研究，必將為研發(fā)抗腫瘤藥物及腫瘤治療提供新的思路。

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