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    適于AFLP分析的大麻干葉DNA快速提取方法研究

    2010-05-23 02:31:38胡尊紅郭鴻彥許艷萍張慶瀅郭孟璧伍菊仙
    中國麻業(yè)科學(xué) 2010年3期
    關(guān)鍵詞:瓊脂糖大麻純度

    胡尊紅 ,陳 璇 ,郭鴻彥 ,許艷萍 ,張慶瀅 ,郭孟璧 ,伍菊仙 ,楊 明 *

    (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),昆明,650201;2.云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,昆明,650205;3.云南工業(yè)大麻股份有限公司,昆明,650217)

    大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科(Cannabinance)大麻屬(Cannabbis)一年生草本植物,多為雌雄異株,雌雄比例為1:1[1]。我國大麻種質(zhì)資料豐富,有著悠久的栽培利用歷史。其經(jīng)濟(jì)利用價值涉及紡織、建材及造紙等各個方面[2]。

    擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)是由荷蘭Vos.P和Zabeau M(1995)創(chuàng)建發(fā)展的一種新的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[3]。AFLP技術(shù)是RFLP和RAPD技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物,其多態(tài)性強(qiáng),試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好,被認(rèn)為是一種較為理想的高效分子標(biāo)記技術(shù)[4]。DNA提取是分子生物學(xué)試驗(yàn)研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù),而能否提取到高質(zhì)量DNA是AFLP試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。在以前的研究中大多數(shù)學(xué)者都是以大麻新鮮嫩葉片作為DNA提取的材料[5-9],用新鮮嫩葉提取DNA可以滿足一般分子試驗(yàn)要求,但對于遠(yuǎn)距離采樣或不具備超低溫保存的條件下,新鮮嫩葉不宜長期保存,為了防止試驗(yàn)材料降解,特別是遠(yuǎn)距離采集珍貴野外材料,通常需對材料進(jìn)行采用變性硅膠或烘干處理保存。同時,由于大麻毒品的販賣形式常為制干的花葉部分,通過對其提取DNA進(jìn)行鑒定,可以鑒定該樣品的所屬品種,從而初步推斷出它的來源地。目前尚未有關(guān)于對大麻植物干燥花葉材料DNA提取方法研究的報道。據(jù)文獻(xiàn)報道,王婷等[10](2008)采用改良CTAB法從變色硅膠干燥的忍冬葉片中提取的DNA質(zhì)量與鮮葉無明顯差異,完整性好,純度高而且干燥葉片產(chǎn)率更高,能被EcoR I完全酶切。郝崗平等[11](2006)在傳統(tǒng)CTAB法基礎(chǔ)上以泰山白花丹參干葉片比較了4種DNA提取方法,獲得了一種簡便、快速分離高質(zhì)量完整DNA的方法,所得的DNA可直接用于AFLP分析,另外還有從其他植物干材料提取高質(zhì)量DNA的相關(guān)報道[12-16]。為了滿足科研和禁毒工作的實(shí)際需求,減少工作量和材料保存成本,本研究利用大麻干葉快速提取基因組DNA并進(jìn)行AFLP-PCR擴(kuò)增,其操作簡便,又節(jié)省時間和成本,具有良好的重復(fù)性,為大麻AFLP遺傳分析研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究所用大麻材料(Cannabis sativa L.)均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供,避光保存時間兩年以上的大麻干葉材料為Ym8 Ym39 Ym81 Ym102 Ym265等共23份。

    主要試劑:CTAB、EDTA、PVP-40、β-巰基乙醇、抗壞血酸、RNaseA酶、瓊脂糖等試劑購自昆明森格瑪公司;EcoRI、MseI、T4 ligase、Taq 酶、dNTP、MgCl2 等購自 Fermentas公司。

    主要儀器:DNA擴(kuò)增儀(Bio-Rad 9700,美國),紫外凝膠成像儀(Bio-Rad UVP GDS-8000,美國),高速冷凍離心機(jī)(Hermle Labortechnlk,德國),多用電泳儀電源(DYY-12C,北京),測序電泳儀(JUNYI,北京),純水儀(Aquapro,重慶),紫外分光光度計(jì)(UV-7504,上海)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大麻干葉DNA提取

    本研究在傳統(tǒng)的植物基因組提取CTAB法基礎(chǔ)上做如下4種改進(jìn)處理,目的是高效防止DNA褐化,并去除多糖、酚類化合物。

    具體方法如下:

    稱取約0.5g大麻干葉樣放入研缽中,并加入少量石英沙,用液氮迅速研磨成粉末,越細(xì)越好,將粉末轉(zhuǎn)至1.5mL離心管,再加入800μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液(2%CTAB,1.4MNaCl,100mM Tris-HCl pH 8.0,20mMEDTA pH 8.0,各處理組分),65℃水浴1h,每隔10分鐘搖動一次;4℃12000rpm下離心15min,取上清液加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)顛倒充分混勻,靜置約5min;4℃12000rpm下離心10min,取上清液加入等體積氯仿-異戊醇(24:1),輕搖混勻,靜置3-5min;4℃12000rpm下離心10min,取上清液加入2/3體積的冰凍異丙醇(-20℃),輕搖混勻,-20℃下沉淀DNA30-60 min;4℃10000rpm下離心10min,棄上清液(或用槍頭挑起沉淀),用預(yù)冷的70%乙醇浸洗沉淀2次,每次30min,離心后在超凈工作臺上充分風(fēng)干,加入200μL 1xTE(pH8.0)溶解 DNA。

    1.2.2 大麻干葉DNA純化

    溶解好的基因組DNA,加入2μL10mg/mLRNase,37℃水浴1h,消化RNA;再加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1),輕搖混勻后,12000rpm下離心10min;取上清液,加入1/10倍體積的3MNaAc(PH 5.4)及預(yù)冷的2倍體積無水乙醇,輕搖混勻后,-20℃靜置約30min,沉淀DNA;用預(yù)冷的70%乙醇浸洗沉淀2次,無水乙醇浸洗1次,每次20min,離心后在超凈工作臺上充分風(fēng)干,加100μL 1xTE(pH8.0)溶解。取適量DNA測定其濃度和純度,其余樣品在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 DNA純度、濃度檢測

    (1)紫外吸收檢測:

    四個方法提取的DNA樣品各取2μL,用ddH2O稀釋50倍,用ddH2O為空白對照,在紫外分分光光度計(jì)上測定OD260、OD280值及OD260/OD280的比值,并用OD260/OD280比值估算DNA的純度,DNA濃度(ug/mL)=OD260×50×稀釋倍數(shù)。

    (2)瓊脂糖凝膠電泳檢測:

    取5μLDNA樣品在O.8%瓊脂糖凝膠上電泳(0.5×TBE),QuantityOne凝膠成像儀觀察并照相,比較不同方法提取大麻干葉的DNA的帶型,并通過和λDNA的亮度對比來估計(jì)基因組DNA濃度。

    1.2.4 AFLP-PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳

    參照Vos等[3](1995)的方法,略有改動。

    首先在37下用限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI對DNA進(jìn)行雙酶切,經(jīng)檢測完全酶切的產(chǎn)物加入T4連接酶在16-22℃過夜連接;連接產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后用銀染法檢測。

    2 .結(jié)果與分析

    2.1 大麻干葉DNA提取方法比較

    DNA的質(zhì)量是AFLP成功與否的關(guān)鍵,通過對常用的3個抗氧化劑:巰基乙醇、PVP及抗壞血酸進(jìn)行組合形成了四個處理,利用這四個處理提取同一批大麻干葉DNA,并進(jìn)行瓊脂糖電泳(圖1)??梢钥闯?,METHOD3處理提取的DNA電泳條帶清晰不拖尾,無蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)殘留膠孔,說明其完整性好、純度較高。METHOD1處理提取的DNA條帶淡,膠孔發(fā)亮,說明DNA產(chǎn)率低,還殘留蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì);METHOD2處理?xiàng)l帶清晰但暗淡,說明完整性好但產(chǎn)率太低。METHOD4處理和METHOD3處理效果類似,提取的DNA條帶清晰,無明顯降解,但METHOD4處理點(diǎn)樣孔有雜質(zhì)滯留,說明在METHOD3處理的基礎(chǔ)上添加100mmol/L抗壞血酸反而不能很好去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。四個處理提取的DNA在紫外分光光度計(jì)上測定其純度及濃度(表1),同樣說明了用METHOD3處理來提取大麻基因組DNA效果最佳。鑒于以上結(jié)果,采用METHOD3處理提取了五個大麻品種干葉DNA(圖2),呈現(xiàn)出DNA條帶清晰無拖尾,完整性好,純度高等特點(diǎn)。

    2.2 AFLP分析

    將METHOD3處理提取到的大麻DNA樣品經(jīng)酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增后,用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染法檢測并拍照。

    DNA能否充分酶切是AFLP指紋圖譜真實(shí)與否的關(guān)鍵,不完全酶切的產(chǎn)物會導(dǎo)致后期擴(kuò)增帶型不穩(wěn)定,不能充分反映擴(kuò)增DNA片段真實(shí)的多態(tài)性,而高質(zhì)量的DNA又是高效酶切的前提和保證。把METHOD3處理提取得到的DNA經(jīng)EcoR I/Mse I雙酶切,并進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳(圖3)。電泳檢測結(jié)果可知,酶切后的DNA片段呈彌散(smear)狀,看不見大分子的DNA,且片段小于1000bp,多集中在500bp以下,說明基因組DNA已被EcoR I/Mse I完全酶切,可以用來進(jìn)行AFLP的后續(xù)工作。

    圖1 不同處理方法提取的大麻干葉基因組DNA的瓊脂糖電泳圖譜Figure 1.The pattern ofgenomic DNAextracted fromdried hemp leaves bydifferent methods

    表1 不同處理方法提取的大麻DNA樣品純度及濃度檢測Table 1 DNApurityand yield detected byUV-Spectrometer

    圖2 METHOD3處理提取不同大麻干葉基因組DNA電泳圖譜Figure 2.The pattern ofgenomic DNAfromdifferent dried hemp leaves byMETHOD3

    圖3 METHOD3法提取DNA的酶切鑒定Figure 3.Enzyme digestion identification of genomic DNA extracted byMETHOD3

    圖4 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Figure 4.Electrophoretic pattern ofpre-amplification

    圖5 選擇性擴(kuò)增聚炳烯酰胺圖譜Figure 5.Electrophoretic pattern ofselective amplification

    AFLP擴(kuò)增體系包括預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩個環(huán)節(jié),預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量直接關(guān)系下一步的選擴(kuò)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(圖4),擴(kuò)增片段小于1000bp,且多集中在500bp以下,條帶亮,符合預(yù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。在AFLP選擇性擴(kuò)增中,使用E33/M49引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)變性后在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,銀染、顯色后條帶清晰、多態(tài)性豐富(圖5)

    3 討 論

    DNA質(zhì)量是AFLP成功的關(guān)鍵,其中影響AFLP主要的物質(zhì)是酚類物質(zhì)、多糖、單寧等,這些物質(zhì)的存在不僅影響酶切的效果而且還影響后續(xù)PCR反應(yīng)中Polymerase的活性[10,11]。在不同植物材料或相同材料不同部位中這些物質(zhì)的含量都不一樣,大麻花葉中含這化合物較多,尤其是酚類化合物,目前報道的已有61種[1],酚類物質(zhì)在DNA提取過程中極易被氧化,而使提取的大麻DNA呈黃色或褐色,而且含有雜質(zhì)。針對這種情況,本試驗(yàn)在傳統(tǒng)CTAB法上進(jìn)行了改良,添加不同的抗酚類氧化褐變物質(zhì),以篩選出適宜AFLP分析的大麻基因組DNA提取的有效方法。本試驗(yàn)證明,在CTAB提取液中添加了2%β-巰基乙醇(V/V)和3%PVP-40(V/V),能夠有效的防止酚類化合物的氧化,同時DNA得率也較高。β-巰基乙醇作為還原劑,可以防止酚類物質(zhì)的氧化;PVP作為螯合劑能夠結(jié)合多酚化合物,增加DNA提取物的溶解性,并在離心過程中可被直接除去。在試驗(yàn)過程中METHOD1和METHOD2中都加有抗壞血酸,然而提取的DNA質(zhì)量和濃度并不理想,甚至還有雜質(zhì)殘留;另外,用METHOD4處理(基本提取液+2%β-巰基乙醇(V/V)+3%PVP-40(M/V)+100mmol/L抗壞血酸)提取的DNA雖然有著較高的得率,但是仍然有蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)殘留膠孔,究其原因可能是由于抗壞血酸的加入改變了提取液中離子條件,又或者是其本身和其它物質(zhì)相互作用而導(dǎo)致提取液在離心過程中去除蛋白、多糖的能力下降。

    DNA提取固然重要,但是DNA的純化也直接影響著DNA的質(zhì)量,本試驗(yàn)在添加RNase消化RNA后,加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)來去除溶液中殘留的蛋白質(zhì),離心后加入1/10倍體積的3MNaAc(PH 5.4)及預(yù)冷的2倍體積無水乙醇來沉淀基因組DNA,這樣就保證了溶液中多糖、金屬離子及其它雜質(zhì)被乙醇充分溶解,從而保證了DNA的純度。

    完全酶切是AFLP成功基礎(chǔ),也是保證試驗(yàn)結(jié)果可靠的前提,在該步驟中本試驗(yàn)采取了分次加限制性內(nèi)切酶的方法,這樣就保證了酶的活性,讓基因組DNA在最短的時間內(nèi)得到了充分的酶切。

    4 結(jié) 論

    本研究對如何從大麻干葉中提取高質(zhì)量的適合AFLP試驗(yàn)的基因組DNA進(jìn)行了探討,結(jié)果表明,在CTAB提取液中添加2%β-巰基乙醇(V/V)和3%PVP-40(M/V)能夠提取到高質(zhì)量的基因組DNA,經(jīng)過AFLP的試驗(yàn)驗(yàn)證,該方法完全適合提取大麻干葉中基因組DNA來進(jìn)行AFLP分析。

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