• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展

    2010-05-23 02:31:38曹秀華阮奇城林海紅胡開輝孫淑靜祁建民
    中國麻業(yè)科學(xué) 2010年3期
    關(guān)鍵詞:異構(gòu)酶木糖釀酒

    曹秀華,阮奇城,林海紅,胡開輝,孫淑靜,祁建民

    (福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

    農(nóng)作物秸稈是一種具有多用途的可再生生物資源,也是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)之一。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)作物秸稈數(shù)量大、種類多、分布廣,長期以來則作為主要燃料或廢棄、焚燒。嚴(yán)重污染了大氣環(huán)境,制約了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展。能源危機(jī)已迫在眉睫,開發(fā)可再生能源已成為我國必須面對的重要課題。以淀粉類和糖類為原料生產(chǎn)燃料乙醇,考慮到糧食安全,已被叫停。以農(nóng)作物纖維素類生產(chǎn)燃料乙醇,適應(yīng)我國國情發(fā)展方向。目前,國際上纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化仍存在三大技術(shù)瓶頸,一是將木質(zhì)纖維素類原料降解產(chǎn)生的木糖轉(zhuǎn)化成乙醇較難,二是纖維素酶生產(chǎn)成本仍然偏高,三是原料要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,可達(dá)植物纖維原料水解糖液的30%[1],但木糖等五碳糖不能由傳統(tǒng)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。因此,篩選到能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的高效菌株,在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化燃料酒精的研究中具有重大意義。

    1 木糖發(fā)酵菌種,包括天然菌種和基因工程菌株

    目前在自然界中篩選到的能將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物主要有:細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌。代謝木糖產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌種類很多,除了能發(fā)酵單糖外還能發(fā)酵纖維素、生物高聚糖等,但細(xì)菌在發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物且乙醇得率低,易染雜菌等。Lynda等發(fā)現(xiàn)一株極端嗜熱的產(chǎn)乙醇細(xì)菌(Thermoanerobacter ethanolicus)可在 68℃高溫下采用連續(xù)培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化木糖獲得乙醇,其得率可達(dá)0.144g/g。絲狀真菌中能利用木糖產(chǎn)乙醇的菌種較少,相關(guān)研究不多。有粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)等。絲狀真菌能產(chǎn)半纖維素酶和纖維素酶,適于植物纖維原料的同步糖化發(fā)酵。與細(xì)菌的乙醇發(fā)酵相比,酵母菌具有酒精轉(zhuǎn)化率高、得率高、酒精耐受能力高、副產(chǎn)物少、發(fā)酵過程不易污染等優(yōu)點(diǎn)。酵母菌中可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌有:嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)、酒香酵母(Bret tanomyces anomalus)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)等[2]。宋安東等曾用嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)對木糖和葡萄糖混合液共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇,發(fā)酵過程中糖利用率較高,發(fā)酵過程中先利用葡萄糖,在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌體生長和乙醇產(chǎn)生隨發(fā)酵時(shí)間延長而改變,發(fā)酵醪液中乙醇濃度為2%[3]。近年來許多研究者構(gòu)建了可以同時(shí)高效代謝五碳糖和六碳糖的基因重組菌,對纖維質(zhì)乙醇發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率有很大提高。

    2 木糖發(fā)酵乙醇機(jī)理

    將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌的木糖代謝途徑是不同的。大多數(shù)細(xì)菌(如E.coli和Bacillus等)首先在木糖異構(gòu)酶作用下,將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化成磷酸木酮糖,繼而進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)(ppp途徑)代謝,ED途徑與ppp途徑耦聯(lián),ED途徑產(chǎn)生乙醇[4]。

    利用木糖的酵母和絲狀真菌的木糖代謝途徑,首先是在依賴NADPH的木糖還原酶(XR)的作用下將木糖還原成木糖醇,然后在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖,再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖,進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PPP)。PPP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶還原為乙醇;或在好氧條件下,通過TCA循環(huán)及呼吸鏈徹底氧化成CO2[5]。酵母的木糖發(fā)酵在兼性厭氧條件下進(jìn)行,其總反應(yīng)式為:

    所以,木糖乙醇發(fā)酵乙醇的最高理論產(chǎn)率為0.46g酒精/g葡萄糖。低于葡萄糖酒精發(fā)酵的理論得率0.51g酒精/g葡萄糖。

    3 木糖發(fā)酵菌的基因工程改良

    能進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵的天然菌種很少,通過基因工程技術(shù)獲得新的菌種可提高木糖乙醇發(fā)酵能力,宿主菌株主要集中在大腸桿菌(E.coli)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)和釀酒酵母(S.cerevisiae)上。

    3.1 木糖發(fā)酵重組細(xì)菌的構(gòu)建

    大腸桿菌(E.coli)含有利用木糖的所有必需酶,但厭氧條件下發(fā)酵形成的產(chǎn)物很復(fù)雜,包括乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸等,乙醇只是其中很少的一部分。生成乙醇的最后階段是由丙酮酸脫羧酶(pdc)和乙醇脫氫酶(adh)催化進(jìn)行的,E.coli缺少pdc,且adh水平低。KO11即是E.coli的基因重組菌株,能過量表達(dá)來自Z.mobilis的丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB,從而能高效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇,乙醇產(chǎn)率為理論值的85%-92%[6]。孫金鳳等從Z.mobilis的DNA中擴(kuò)增出pdc、adhB,分別用lac啟動(dòng)子控制表達(dá),構(gòu)建了可以在E.coli JM109中表達(dá)的重組質(zhì)粒pKK-PA、pEtac-PA,得到的重組菌幾乎專一的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇[7]。楊秀山等構(gòu)建的大腸桿菌E.coli(pGM-PA)使乙醇產(chǎn)量有了明顯的提高,固定化E.coli(pGM-PA)發(fā)酵混合糖的乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值的85%,木糖利用率達(dá)到80%,混合糖利用率達(dá)83%[4]。

    Zhang等利用基因克隆在Z.mobilis中構(gòu)建了能產(chǎn)生木糖異構(gòu)酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、轉(zhuǎn)酮酶(tktA)、轉(zhuǎn)醛酶(tal)的菌株。獲得的重組菌Z.mobilis CP4(pZB5)可以五碳糖為碳源,乙醇產(chǎn)量可達(dá)理論產(chǎn)率的86%;在含木糖和葡萄糖各為25 g/L的混合碳源中培養(yǎng),兩種糖的乙醇產(chǎn)率均達(dá)到理論值的95%[8]。Mohagheghi等將發(fā)酵木糖和阿拉伯糖所需的7個(gè)基因整合到Z.mobilis染色體上的特異位點(diǎn)——乳酸脫氫酶基因(ldh)中,獲得了一株穩(wěn)定的整合重組菌株AX101,在賦予新菌株發(fā)酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同時(shí),也減少了副產(chǎn)物乳酸的生成[9]。但重組菌株由于引入的基因存在于質(zhì)粒上,穩(wěn)定性較差,經(jīng)連續(xù)發(fā)酵后質(zhì)粒容易丟失而使發(fā)酵能力下降,并且對乙醇及纖維原料水解液中的抑制物耐受性差。

    3.2 酵母菌的木糖代謝工程改造

    釀酒酵母(S.cerevisiae)是傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)菌株,具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀,其全序列已測定,遺傳操作技術(shù)也已經(jīng)成熟[10]。雖然釀酒酵母不能直接利用木糖,卻具備木酮糖代謝的完整酶系[11]。不過,酒精代謝屬于初級代謝,大多數(shù)微生物分享大量共同代謝途徑,因此擴(kuò)大釀酒酵母的底物范圍,提高其對木糖的利用只需添加少數(shù)幾個(gè)酶反應(yīng)步驟即可。通常,微生物經(jīng)2條獨(dú)立路線將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,一是在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的共同作用下分2步反應(yīng)完成,常存在于酵母中;二是通過木糖異構(gòu)酶直接轉(zhuǎn)化為木酮糖,該反應(yīng)在細(xì)菌中很典型[12]。通過途徑工程理念,改造釀酒酵母代謝途徑,使其具有共發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精的能力,以此提高酒精轉(zhuǎn)化率[13]。

    早在1990年,Kotter等將樹干畢赤氏酵母的木糖還原酶基因(XYL1)與木糖醇脫氫酶基因(XYL2)克隆到釀酒酵母中。重組酵母能在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長,但不能發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇,所利用的木糖全部被氧化[14]。

    但研究發(fā)現(xiàn),XYL1與XYL2相對表達(dá)水平的變化影響乙醇轉(zhuǎn)化率;XYL2表達(dá)量的進(jìn)一步提高,會(huì)導(dǎo)致木酮糖的累積分泌。木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖成為木糖代謝的限速步驟之一[15]。木酮糖激酶是木糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,釀酒酵母自身的表達(dá)活性很低。如果過量表達(dá)木酮糖激酶,對木酮糖無限制的磷酸化催化在某種程度上會(huì)耗盡胞內(nèi)ATP,從而引起細(xì)胞生長的毒害[16]。因此,木酮糖激酶的表達(dá)必須維持較適宜的水平。最近,Karhumaa等對嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus的XI基因、XK基因及眾多非氧化磷酸化途徑酶基因的酵母菌株進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對木糖的有效利用不僅依賴于從木糖到木酮糖的有效轉(zhuǎn)化,也依賴于非氧化磷酸化途徑對木酮糖的進(jìn)一步有效代謝[17]。轉(zhuǎn)酮酶(Transketolase,Tkl1)和轉(zhuǎn)醛酶(Transaldolase,Tal1)是PPP途徑中的關(guān)鍵酶,影響重組菌發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的能力,但釀酒酵母的這兩種酶酶活都較低。鮑曉明等[18]以E.coli-S.cerevisiae穿梭質(zhì)粒YEp24為骨架,將Pichia stipitis CBS6054的xyl1及xyl2分別放在釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅰ(ADH1)啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子下,構(gòu)建不同的xyl1及xyl2重組質(zhì)粒,并在重組菌株中引入Tkl1和Tal1基因,使酵母菌在原有水平的基礎(chǔ)上超表達(dá)合成轉(zhuǎn)酮酶及轉(zhuǎn)醛酶,這樣得到的重組菌株可以在木糖為唯一碳源的平板上生長。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,xyl1/xyl2比值為0.06的菌株,木糖較少被氧化,其他副產(chǎn)物也有所下降,乙醇得率有所提高。

    引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的又一途徑。細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶因不需要任何輔助因子,最初被認(rèn)為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母代謝工程菌株的便利途徑。早期多個(gè)研究將多種來源如E.coli、Bacillus subtilis、Actinoplanes missouriensis等的木糖異構(gòu)酶基因克隆轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,甚至已從重組酵母中得到外源xylA基因正確大小的蛋白產(chǎn)物,但均沒有得到活性表達(dá)[19],其可能原因是細(xì)菌和酵母最適pH不同,酶折疊不正確,或者后期翻譯模式不合適[20]。直到1996年,Walfridsson等將古細(xì)菌嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)的木糖異構(gòu)酶基因(xylA)轉(zhuǎn)入釀酒酵母,首次在釀酒酵母突變株XI中得到了活性表達(dá)[21]。Lonn等用易錯(cuò)PCR方法對T.thermophilus的xylA進(jìn)行定向改造,以此解決其最適反應(yīng)溫度過高的問題,但效果仍不理想。突變株XI最適反應(yīng)溫度降至60℃,但其熱穩(wěn)定性卻大大降低[22]。鮑曉明等從Thermus thermophilus克隆得到xylA,轉(zhuǎn)化釀酒酵母,成功地在釀酒酵母中得到木糖異構(gòu)酶活性表達(dá),同時(shí)表達(dá)xylA和超表達(dá)TKl1和TAl1的釀酒酵母重組菌可以在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長,經(jīng)搖瓶發(fā)酵,該菌株可以發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇,產(chǎn)量為1.3 g/L[23]。

    4 展 望

    木質(zhì)纖維原料的主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素,在木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為酒精過程中,如果能高效的將木糖轉(zhuǎn)化為酒精,在理論上可提高乙醇產(chǎn)量達(dá)25%,可降低生產(chǎn)成本。由于很難在自然界中篩選到高效的木糖發(fā)酵菌,所以研究者開始致力于構(gòu)建能高效利用六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的基因重組菌。目前基因重組菌的構(gòu)建主要包括兩個(gè)方面:一是將戊糖代謝途徑引入只能代謝六碳糖產(chǎn)乙醇的菌株中;二是將高效產(chǎn)乙醇關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入能代謝六碳糖和五碳糖但乙醇產(chǎn)量低的菌株中。目前研究表明,通過基因重組可以獲得能高效轉(zhuǎn)化六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的重組菌株。但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問題,主要包括:菌種底物范圍??;乙酸等抑制物耐受性低;乙醇耐受性較低;重組菌株不穩(wěn)定;發(fā)酵過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物并影響其發(fā)酵;發(fā)酵工藝需改良優(yōu)化等。另外,所得重組菌株的應(yīng)用還限制在實(shí)驗(yàn)室范圍,還沒有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此,繼續(xù)并加強(qiáng)對重組菌株構(gòu)建和木糖代謝的研究,對提高木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化乙醇有十分重要的意義。

    [1]RodneyJB,NancyN,Bruce SD.Fermentations with newrecombinant organisms[J].Biotechnol.Prog.,1999,15,867-875.

    [2] 楊喜愛,彭源德.木糖乙醇發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展與前景[J].中國麻業(yè)科學(xué),2006,28(5):262-266.

    [3] 宋安東,耿欣,等.戊糖和己糖共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇過程動(dòng)力學(xué)研究[J].釀酒科技,2005,(2):39-41.

    [4] 田沈,姚瑩秋,藺增曦,等.木質(zhì)纖維素稀酸水解糖液乙醇發(fā)酵研究進(jìn)展[J],微生物學(xué)通報(bào),2007,34(2):355-358.

    [5] Hahn-Hagerdal B,Jeppsson H,SkoogK,et al.Biochemistry and physiology of xylose fermentation by yeasts[J].Enzyme Microb.Technol.,1994,16:933-943.

    [6]Bothast RJ,Nichols NN,Dien BS.Fermentation with newrecombinant organisms[J].Biotechnol.Prog,1999,15:875-881.

    [7] 孫金鳳,徐敏,張峰,等.利用木糖和葡萄糖合成乙醇的新型重組大腸桿菌的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2004,44(5):600-604.

    [8] Min Zhang,Christina E,Kristine D,et al.Metabolic Engineering of a Pentose Metabolism Pathway in Ethanologenic Zymomonas mobilis[J].Science,1995,267:240-243.

    [9]Mohagheghi A,Evans K,Chou YC,et al.Cofermentation of Glucose,Xylose,and Arabinose byGenomic DNA-integrated Xylose/Arabinose FermentingStrain ofZymomonas mobilis AX101[J].Appl.Biochem.Biotechnol.,2002,98:885-898.

    [10]Goffeau A,Barrell BG,BusseyB,et al.Life with 6000 genes[J].Science,1996,274(5287):546,563-567.

    [11] Peter R,Mervi H,Merja P.The role of xylulokinase in Saccharomyces cerevisiae xylulose catabolism.FEMS Microbiology Letters,2000,190:39-43.

    [12]Gregory N.Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou,Jens Nielsen,著;趙學(xué)明,白冬梅,等譯.代謝工程——原理與方法[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2003,12:128-130.

    [13] Aristos A,Penttila M.Metabolic engineeringapplications torenewable resource utilization.Curr.Opin.Biotechnol.,2000,1(2):187-198.

    [14] Kotter P,Amore R,HollenbergCP,et al.Isolation and characterization of the Pichia Stipitis xylitol dehydrogenase gene,XYL2,and construction ofa xylose-utilizingSaccharomyces cerevisiae transformant[J].Curr.Genet.,1990,18:493-500.

    [15] Amore R,Kotter P,Kuster C,et al.Cloning and Expression in Saccharomyces cerevisiae of the NAD(P)H-dependent xylose Reductase encodingGene(XYL1)fromthe xylose-assimilatingYeast Pichia stipitis[J].Gene,1991,109:89-97.

    [16] Johansson B,Christensson C,Hobley T,et al.Xylulokinase overexpression in two strains of Saccharomyces cerevisiae also expressingxylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermentation ofxylose and lignocellulosic hydrolysate[J].Appl.Environ.Microbiol.,2001,67:4249-4255.

    [17] Karhumaa K,Hahn-Hagerdal B,Gorwa-Grauslund MF.Investigation of limiting metabolic steps in the utilization of xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae usingmetabolic engineering[J].Yeast,2005,22(5):359-368.

    [18] 鮑曉明,高東,王祖農(nóng),等.木糖代謝基因表達(dá)水平對釀酒酵母重組菌株產(chǎn)物形成的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),1997,13(4):355-361.

    [19] Rene A,Martin W,Cornelis PH.The fermentation of xylose—ananalysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast.Appl.Microbiol.Biotechnol.1989,30:351-357.

    [20]DumsdayGJ,Jones K,Pamment NB.Recombinant organisms for ethanol production fromhemicellulosic hydrolyzates:a reviewof recent progress.Aust.Biotechnol.,1997,7:285-295.

    [21]Walfridsson M,XiaomingB,Hahn-Hagerdal B,et al.Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Thermus thermophilus xylA gene,which expresses an active xylose (glucose)isomerase.Appl.Microbiol.Biotechnol.,1996,62:4648-4651.

    [22] Lonn A,Gardonyl M,Hahn-Hagerdal B,et al.Cold adaptation of xylose isomerase from through random PCR mutagenesis.Eur.J.Biochem.,2002,269(1):157-163.

    [23] 鮑曉明,高東,王祖農(nóng).嗜熱細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因xylA在釀酒酵母中的高效表達(dá)[J].微生物學(xué)報(bào),1999,39(1):49-54.

    猜你喜歡
    異構(gòu)酶木糖釀酒
    一個(gè)空瓶
    有心的小蘑菇
    布谷鳥讀信
    上半年釀酒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)、銷、利均增長
    釀酒科技(2021年8期)2021-12-06 15:28:22
    為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
    印度合成新型化合物可殺死癌細(xì)胞
    祝您健康(2019年7期)2019-07-12 03:11:52
    紅花查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析
    釀酒忘米
    低聚木糖在家禽中的應(yīng)用
    廣東飼料(2016年8期)2016-02-27 11:10:01
    建立NHEJ修復(fù)定量體系并檢測拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑依托泊苷對NHEJ的影響
    每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看午夜福利视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 波多野结衣巨乳人妻| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 少妇丰满av| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av.av天堂| 欧美bdsm另类| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲综合色惰| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 丰满乱子伦码专区| 岛国在线免费视频观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本熟妇午夜| 热99在线观看视频| 99riav亚洲国产免费| 日韩欧美在线二视频| 搞女人的毛片| 日韩欧美精品v在线| 亚洲av电影在线进入| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲专区国产一区二区| 久久中文看片网| 久久久久国内视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品久久久久久精品电影| 夜夜爽天天搞| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精品成人久久久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 国产久久久一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 在现免费观看毛片| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av成人av| aaaaa片日本免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产高清视频在线播放一区| 少妇的逼好多水| 久久久国产成人免费| 成人美女网站在线观看视频| 精品国产亚洲在线| 午夜福利免费观看在线| 国产精品久久久久久久久免 | 成人特级av手机在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av成人av| 国产亚洲欧美98| 韩国av一区二区三区四区| av在线观看视频网站免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91狼人影院| 午夜福利18| 一夜夜www| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产探花极品一区二区| www.色视频.com| 日韩高清综合在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成年女人永久免费观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 18+在线观看网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 色综合站精品国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久午夜亚洲精品久久| 脱女人内裤的视频| 国产三级在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 香蕉av资源在线| a在线观看视频网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 两个人的视频大全免费| 亚洲国产欧美人成| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 亚洲自偷自拍三级| 国内精品久久久久久久电影| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美bdsm另类| 国产淫片久久久久久久久 | 久久久久久久久久黄片| 久久久久性生活片| 国内精品一区二区在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费看a级黄色片| 男女之事视频高清在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久香蕉精品热| 精品午夜福利在线看| 无遮挡黄片免费观看| а√天堂www在线а√下载| 成熟少妇高潮喷水视频| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产单亲对白刺激| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人福利小说| 国产精品久久久久久久久免 | 性色av乱码一区二区三区2| 色av中文字幕| 国内精品美女久久久久久| 亚洲无线在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美最新免费一区二区三区 | 日本在线视频免费播放| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品女同一区二区软件 | 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av.av天堂| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 一进一出好大好爽视频| 午夜激情福利司机影院| 波野结衣二区三区在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久成人免费电影| 日韩亚洲欧美综合| 又黄又爽又免费观看的视频| 色吧在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | av国产免费在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费在线观看日本一区| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产色片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费高清视频大片| 欧美黄色淫秽网站| 精品国产亚洲在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩欧美国产一区二区入口| 色播亚洲综合网| 久久久精品大字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久九九精品影院| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久久久大av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲,欧美,日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产成人福利小说| 黄色丝袜av网址大全| 老熟妇仑乱视频hdxx| 超碰av人人做人人爽久久| 日本在线视频免费播放| 午夜影院日韩av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男女视频在线观看网站免费| 窝窝影院91人妻| 亚洲国产精品sss在线观看| 十八禁人妻一区二区| 久久久久久久久中文| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美精品啪啪一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va | 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产色婷婷99| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产美女午夜福利| 免费av不卡在线播放| 国产精品三级大全| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲色图av天堂| 一a级毛片在线观看| 日本a在线网址| 男人的好看免费观看在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av熟女| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美区成人在线视频| av欧美777| 国产伦人伦偷精品视频| 国产成人啪精品午夜网站| 在线观看66精品国产| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜福利在线在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 91字幕亚洲| 国产乱人视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲av.av天堂| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品永久免费网站| 精品福利观看| 少妇丰满av| 久久精品综合一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲人与动物交配视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产三级黄色录像| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99热精品在线国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲成av人片免费观看| 日日夜夜操网爽| 国产男靠女视频免费网站| 成人av一区二区三区在线看| 少妇被粗大猛烈的视频| 岛国在线免费视频观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99在线人妻在线中文字幕| 男女视频在线观看网站免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 全区人妻精品视频| 亚洲内射少妇av| 午夜老司机福利剧场| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av福利片在线观看| 亚洲国产精品999在线| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品不卡国产一区二区三区| 97碰自拍视频| 制服丝袜大香蕉在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 91在线观看av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美激情在线99| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产亚洲在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 1024手机看黄色片| 国产精品野战在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 偷拍熟女少妇极品色| 直男gayav资源| 国产爱豆传媒在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 中文资源天堂在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本免费a在线| 国产69精品久久久久777片| 黄色日韩在线| 嫩草影院精品99| 国产在视频线在精品| 国产av在哪里看| 久久6这里有精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 老熟妇仑乱视频hdxx| 极品教师在线免费播放| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 深夜精品福利| 岛国在线免费视频观看| 精品久久久久久久久久久久久| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲内射少妇av| 亚洲欧美精品综合久久99| 婷婷亚洲欧美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜激情欧美在线| 一个人看视频在线观看www免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 中亚洲国语对白在线视频| 日本一本二区三区精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲第一电影网av| 白带黄色成豆腐渣| 国产免费av片在线观看野外av| 一本一本综合久久| 韩国av一区二区三区四区| av国产免费在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 搡老妇女老女人老熟妇| 一本精品99久久精品77| 亚洲 国产 在线| 免费观看人在逋| av黄色大香蕉| 国产精品影院久久| www.www免费av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| av国产免费在线观看| www.www免费av| 亚洲成av人片在线播放无| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲自偷自拍三级| 一级av片app| 国产午夜福利久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99久久九九国产精品国产免费| 男女床上黄色一级片免费看| 久久99热6这里只有精品| 在线天堂最新版资源| 欧美性感艳星| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 天堂网av新在线| 久久国产乱子免费精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产精品99久久久久久久久| 我要搜黄色片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 制服丝袜大香蕉在线| 成人永久免费在线观看视频| 免费看美女性在线毛片视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品99久久久久久久久| 一夜夜www| 日本熟妇午夜| 欧美黑人巨大hd| 黄色日韩在线| 日本一二三区视频观看| 国产极品精品免费视频能看的| 男人的好看免费观看在线视频| 久久香蕉精品热| 久久久久九九精品影院| 精品一区二区三区人妻视频| 久9热在线精品视频| 国内精品美女久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产69精品久久久久777片| 日韩欧美精品v在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美+亚洲+日韩+国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 97碰自拍视频| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜福利18| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产不卡一卡二| 精品日产1卡2卡| 免费看a级黄色片| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲人成网站在线播| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99久久成人亚洲精品观看| 宅男免费午夜| 成人欧美大片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 69av精品久久久久久| 亚洲av二区三区四区| 国模一区二区三区四区视频| 级片在线观看| 长腿黑丝高跟| 亚洲午夜理论影院| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 国产精华一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 女人被狂操c到高潮| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美国产日韩亚洲一区| 十八禁网站免费在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美性感艳星| 亚洲色图av天堂| 高清毛片免费观看视频网站| 1000部很黄的大片| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品日产1卡2卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| av视频在线观看入口| av天堂中文字幕网| 97热精品久久久久久| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人av教育| 最好的美女福利视频网| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产色婷婷99| 18禁在线播放成人免费| 看十八女毛片水多多多| 精品欧美国产一区二区三| 97碰自拍视频| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久久久久大av| 免费在线观看日本一区| 我要搜黄色片| 女同久久另类99精品国产91| 成人性生交大片免费视频hd| 午夜福利18| 内地一区二区视频在线| 深夜精品福利| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 可以在线观看的亚洲视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美另类亚洲清纯唯美| 波多野结衣高清作品| 欧美高清成人免费视频www| 日本免费a在线| 人人妻人人看人人澡| 九色成人免费人妻av| 国产精品不卡视频一区二区 | 欧美日韩黄片免| 国产麻豆成人av免费视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲专区国产一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 精华霜和精华液先用哪个| 中文在线观看免费www的网站| 长腿黑丝高跟| 国产探花极品一区二区| 日本一二三区视频观看| 午夜免费成人在线视频| 国产精品永久免费网站| 成年女人永久免费观看视频| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 内地一区二区视频在线| 哪里可以看免费的av片| 色5月婷婷丁香| 久久午夜福利片| ponron亚洲| 首页视频小说图片口味搜索| 宅男免费午夜| 国产精品不卡视频一区二区 | 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 少妇丰满av| 免费黄网站久久成人精品 | 国产综合懂色| 亚洲,欧美精品.| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲18禁久久av| 中文字幕高清在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成+人综合+亚洲专区| 一夜夜www| .国产精品久久| 亚洲最大成人手机在线| 一区二区三区高清视频在线| 国产人妻一区二区三区在| 我的老师免费观看完整版| 久久久久九九精品影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 婷婷亚洲欧美| 男女视频在线观看网站免费| 国内精品一区二区在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 日本成人三级电影网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲成av人片免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产高潮美女av| 一进一出抽搐动态| 神马国产精品三级电影在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一级av片app| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美精品国产亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久大精品| 成人永久免费在线观看视频| 男女之事视频高清在线观看| 婷婷亚洲欧美| 国模一区二区三区四区视频| 国产视频一区二区在线看| 给我免费播放毛片高清在线观看| av在线蜜桃| 在线看三级毛片| 一级a爱片免费观看的视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品av视频在线免费观看| 一本精品99久久精品77| 久久精品影院6| 免费av观看视频| 51午夜福利影视在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 久久性视频一级片| 三级国产精品欧美在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲色图av天堂| 久久久久九九精品影院| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av免费在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久久久中文| 一夜夜www| .国产精品久久| 国产亚洲精品久久久com| 大型黄色视频在线免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩欧美国产在线观看| 国产av不卡久久| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一个人看的www免费观看视频| 午夜老司机福利剧场| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女 人体艺术 gogo| 日韩欧美精品v在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲av美国av| 国产精品电影一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜免费激情av| 久久精品人妻少妇| 99热这里只有是精品在线观看 | 精品日产1卡2卡| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性感艳星| 亚洲色图av天堂| 国产日本99.免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲乱码一区二区免费版| 看免费av毛片| 国产精品久久视频播放| 日韩成人在线观看一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 97热精品久久久久久| 精品人妻视频免费看| 99久久精品一区二区三区| 日韩高清综合在线| 婷婷色综合大香蕉| 色综合婷婷激情| 久久午夜亚洲精品久久| 久久亚洲精品不卡| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 高清日韩中文字幕在线| 色5月婷婷丁香| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| x7x7x7水蜜桃| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费在线观看亚洲国产|