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    纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展

    2010-05-23 02:31:38曹秀華阮奇城林海紅胡開輝孫淑靜祁建民
    中國麻業(yè)科學(xué) 2010年3期
    關(guān)鍵詞:異構(gòu)酶木糖釀酒

    曹秀華,阮奇城,林海紅,胡開輝,孫淑靜,祁建民

    (福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

    農(nóng)作物秸稈是一種具有多用途的可再生生物資源,也是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)之一。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)作物秸稈數(shù)量大、種類多、分布廣,長期以來則作為主要燃料或廢棄、焚燒。嚴(yán)重污染了大氣環(huán)境,制約了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展。能源危機(jī)已迫在眉睫,開發(fā)可再生能源已成為我國必須面對的重要課題。以淀粉類和糖類為原料生產(chǎn)燃料乙醇,考慮到糧食安全,已被叫停。以農(nóng)作物纖維素類生產(chǎn)燃料乙醇,適應(yīng)我國國情發(fā)展方向。目前,國際上纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化仍存在三大技術(shù)瓶頸,一是將木質(zhì)纖維素類原料降解產(chǎn)生的木糖轉(zhuǎn)化成乙醇較難,二是纖維素酶生產(chǎn)成本仍然偏高,三是原料要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,可達(dá)植物纖維原料水解糖液的30%[1],但木糖等五碳糖不能由傳統(tǒng)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。因此,篩選到能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的高效菌株,在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化燃料酒精的研究中具有重大意義。

    1 木糖發(fā)酵菌種,包括天然菌種和基因工程菌株

    目前在自然界中篩選到的能將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物主要有:細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌。代謝木糖產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌種類很多,除了能發(fā)酵單糖外還能發(fā)酵纖維素、生物高聚糖等,但細(xì)菌在發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物且乙醇得率低,易染雜菌等。Lynda等發(fā)現(xiàn)一株極端嗜熱的產(chǎn)乙醇細(xì)菌(Thermoanerobacter ethanolicus)可在 68℃高溫下采用連續(xù)培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化木糖獲得乙醇,其得率可達(dá)0.144g/g。絲狀真菌中能利用木糖產(chǎn)乙醇的菌種較少,相關(guān)研究不多。有粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)等。絲狀真菌能產(chǎn)半纖維素酶和纖維素酶,適于植物纖維原料的同步糖化發(fā)酵。與細(xì)菌的乙醇發(fā)酵相比,酵母菌具有酒精轉(zhuǎn)化率高、得率高、酒精耐受能力高、副產(chǎn)物少、發(fā)酵過程不易污染等優(yōu)點(diǎn)。酵母菌中可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌有:嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)、酒香酵母(Bret tanomyces anomalus)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)等[2]。宋安東等曾用嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)對木糖和葡萄糖混合液共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇,發(fā)酵過程中糖利用率較高,發(fā)酵過程中先利用葡萄糖,在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌體生長和乙醇產(chǎn)生隨發(fā)酵時(shí)間延長而改變,發(fā)酵醪液中乙醇濃度為2%[3]。近年來許多研究者構(gòu)建了可以同時(shí)高效代謝五碳糖和六碳糖的基因重組菌,對纖維質(zhì)乙醇發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率有很大提高。

    2 木糖發(fā)酵乙醇機(jī)理

    將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌的木糖代謝途徑是不同的。大多數(shù)細(xì)菌(如E.coli和Bacillus等)首先在木糖異構(gòu)酶作用下,將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化成磷酸木酮糖,繼而進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)(ppp途徑)代謝,ED途徑與ppp途徑耦聯(lián),ED途徑產(chǎn)生乙醇[4]。

    利用木糖的酵母和絲狀真菌的木糖代謝途徑,首先是在依賴NADPH的木糖還原酶(XR)的作用下將木糖還原成木糖醇,然后在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖,再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖,進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PPP)。PPP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶還原為乙醇;或在好氧條件下,通過TCA循環(huán)及呼吸鏈徹底氧化成CO2[5]。酵母的木糖發(fā)酵在兼性厭氧條件下進(jìn)行,其總反應(yīng)式為:

    所以,木糖乙醇發(fā)酵乙醇的最高理論產(chǎn)率為0.46g酒精/g葡萄糖。低于葡萄糖酒精發(fā)酵的理論得率0.51g酒精/g葡萄糖。

    3 木糖發(fā)酵菌的基因工程改良

    能進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵的天然菌種很少,通過基因工程技術(shù)獲得新的菌種可提高木糖乙醇發(fā)酵能力,宿主菌株主要集中在大腸桿菌(E.coli)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)和釀酒酵母(S.cerevisiae)上。

    3.1 木糖發(fā)酵重組細(xì)菌的構(gòu)建

    大腸桿菌(E.coli)含有利用木糖的所有必需酶,但厭氧條件下發(fā)酵形成的產(chǎn)物很復(fù)雜,包括乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸等,乙醇只是其中很少的一部分。生成乙醇的最后階段是由丙酮酸脫羧酶(pdc)和乙醇脫氫酶(adh)催化進(jìn)行的,E.coli缺少pdc,且adh水平低。KO11即是E.coli的基因重組菌株,能過量表達(dá)來自Z.mobilis的丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB,從而能高效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇,乙醇產(chǎn)率為理論值的85%-92%[6]。孫金鳳等從Z.mobilis的DNA中擴(kuò)增出pdc、adhB,分別用lac啟動(dòng)子控制表達(dá),構(gòu)建了可以在E.coli JM109中表達(dá)的重組質(zhì)粒pKK-PA、pEtac-PA,得到的重組菌幾乎專一的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇[7]。楊秀山等構(gòu)建的大腸桿菌E.coli(pGM-PA)使乙醇產(chǎn)量有了明顯的提高,固定化E.coli(pGM-PA)發(fā)酵混合糖的乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值的85%,木糖利用率達(dá)到80%,混合糖利用率達(dá)83%[4]。

    Zhang等利用基因克隆在Z.mobilis中構(gòu)建了能產(chǎn)生木糖異構(gòu)酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、轉(zhuǎn)酮酶(tktA)、轉(zhuǎn)醛酶(tal)的菌株。獲得的重組菌Z.mobilis CP4(pZB5)可以五碳糖為碳源,乙醇產(chǎn)量可達(dá)理論產(chǎn)率的86%;在含木糖和葡萄糖各為25 g/L的混合碳源中培養(yǎng),兩種糖的乙醇產(chǎn)率均達(dá)到理論值的95%[8]。Mohagheghi等將發(fā)酵木糖和阿拉伯糖所需的7個(gè)基因整合到Z.mobilis染色體上的特異位點(diǎn)——乳酸脫氫酶基因(ldh)中,獲得了一株穩(wěn)定的整合重組菌株AX101,在賦予新菌株發(fā)酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同時(shí),也減少了副產(chǎn)物乳酸的生成[9]。但重組菌株由于引入的基因存在于質(zhì)粒上,穩(wěn)定性較差,經(jīng)連續(xù)發(fā)酵后質(zhì)粒容易丟失而使發(fā)酵能力下降,并且對乙醇及纖維原料水解液中的抑制物耐受性差。

    3.2 酵母菌的木糖代謝工程改造

    釀酒酵母(S.cerevisiae)是傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)菌株,具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀,其全序列已測定,遺傳操作技術(shù)也已經(jīng)成熟[10]。雖然釀酒酵母不能直接利用木糖,卻具備木酮糖代謝的完整酶系[11]。不過,酒精代謝屬于初級代謝,大多數(shù)微生物分享大量共同代謝途徑,因此擴(kuò)大釀酒酵母的底物范圍,提高其對木糖的利用只需添加少數(shù)幾個(gè)酶反應(yīng)步驟即可。通常,微生物經(jīng)2條獨(dú)立路線將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,一是在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的共同作用下分2步反應(yīng)完成,常存在于酵母中;二是通過木糖異構(gòu)酶直接轉(zhuǎn)化為木酮糖,該反應(yīng)在細(xì)菌中很典型[12]。通過途徑工程理念,改造釀酒酵母代謝途徑,使其具有共發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精的能力,以此提高酒精轉(zhuǎn)化率[13]。

    早在1990年,Kotter等將樹干畢赤氏酵母的木糖還原酶基因(XYL1)與木糖醇脫氫酶基因(XYL2)克隆到釀酒酵母中。重組酵母能在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長,但不能發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇,所利用的木糖全部被氧化[14]。

    但研究發(fā)現(xiàn),XYL1與XYL2相對表達(dá)水平的變化影響乙醇轉(zhuǎn)化率;XYL2表達(dá)量的進(jìn)一步提高,會(huì)導(dǎo)致木酮糖的累積分泌。木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖成為木糖代謝的限速步驟之一[15]。木酮糖激酶是木糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,釀酒酵母自身的表達(dá)活性很低。如果過量表達(dá)木酮糖激酶,對木酮糖無限制的磷酸化催化在某種程度上會(huì)耗盡胞內(nèi)ATP,從而引起細(xì)胞生長的毒害[16]。因此,木酮糖激酶的表達(dá)必須維持較適宜的水平。最近,Karhumaa等對嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus的XI基因、XK基因及眾多非氧化磷酸化途徑酶基因的酵母菌株進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對木糖的有效利用不僅依賴于從木糖到木酮糖的有效轉(zhuǎn)化,也依賴于非氧化磷酸化途徑對木酮糖的進(jìn)一步有效代謝[17]。轉(zhuǎn)酮酶(Transketolase,Tkl1)和轉(zhuǎn)醛酶(Transaldolase,Tal1)是PPP途徑中的關(guān)鍵酶,影響重組菌發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的能力,但釀酒酵母的這兩種酶酶活都較低。鮑曉明等[18]以E.coli-S.cerevisiae穿梭質(zhì)粒YEp24為骨架,將Pichia stipitis CBS6054的xyl1及xyl2分別放在釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅰ(ADH1)啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子下,構(gòu)建不同的xyl1及xyl2重組質(zhì)粒,并在重組菌株中引入Tkl1和Tal1基因,使酵母菌在原有水平的基礎(chǔ)上超表達(dá)合成轉(zhuǎn)酮酶及轉(zhuǎn)醛酶,這樣得到的重組菌株可以在木糖為唯一碳源的平板上生長。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,xyl1/xyl2比值為0.06的菌株,木糖較少被氧化,其他副產(chǎn)物也有所下降,乙醇得率有所提高。

    引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的又一途徑。細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶因不需要任何輔助因子,最初被認(rèn)為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母代謝工程菌株的便利途徑。早期多個(gè)研究將多種來源如E.coli、Bacillus subtilis、Actinoplanes missouriensis等的木糖異構(gòu)酶基因克隆轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,甚至已從重組酵母中得到外源xylA基因正確大小的蛋白產(chǎn)物,但均沒有得到活性表達(dá)[19],其可能原因是細(xì)菌和酵母最適pH不同,酶折疊不正確,或者后期翻譯模式不合適[20]。直到1996年,Walfridsson等將古細(xì)菌嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)的木糖異構(gòu)酶基因(xylA)轉(zhuǎn)入釀酒酵母,首次在釀酒酵母突變株XI中得到了活性表達(dá)[21]。Lonn等用易錯(cuò)PCR方法對T.thermophilus的xylA進(jìn)行定向改造,以此解決其最適反應(yīng)溫度過高的問題,但效果仍不理想。突變株XI最適反應(yīng)溫度降至60℃,但其熱穩(wěn)定性卻大大降低[22]。鮑曉明等從Thermus thermophilus克隆得到xylA,轉(zhuǎn)化釀酒酵母,成功地在釀酒酵母中得到木糖異構(gòu)酶活性表達(dá),同時(shí)表達(dá)xylA和超表達(dá)TKl1和TAl1的釀酒酵母重組菌可以在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長,經(jīng)搖瓶發(fā)酵,該菌株可以發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇,產(chǎn)量為1.3 g/L[23]。

    4 展 望

    木質(zhì)纖維原料的主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素,在木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為酒精過程中,如果能高效的將木糖轉(zhuǎn)化為酒精,在理論上可提高乙醇產(chǎn)量達(dá)25%,可降低生產(chǎn)成本。由于很難在自然界中篩選到高效的木糖發(fā)酵菌,所以研究者開始致力于構(gòu)建能高效利用六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的基因重組菌。目前基因重組菌的構(gòu)建主要包括兩個(gè)方面:一是將戊糖代謝途徑引入只能代謝六碳糖產(chǎn)乙醇的菌株中;二是將高效產(chǎn)乙醇關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入能代謝六碳糖和五碳糖但乙醇產(chǎn)量低的菌株中。目前研究表明,通過基因重組可以獲得能高效轉(zhuǎn)化六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的重組菌株。但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問題,主要包括:菌種底物范圍??;乙酸等抑制物耐受性低;乙醇耐受性較低;重組菌株不穩(wěn)定;發(fā)酵過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物并影響其發(fā)酵;發(fā)酵工藝需改良優(yōu)化等。另外,所得重組菌株的應(yīng)用還限制在實(shí)驗(yàn)室范圍,還沒有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此,繼續(xù)并加強(qiáng)對重組菌株構(gòu)建和木糖代謝的研究,對提高木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化乙醇有十分重要的意義。

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