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    耐高溫、高濃度酒精酵母的選育與耐受性能初步鑒定

    2010-05-23 02:32:56彭源德朱作華唐守偉湯清明熊和平
    中國麻業(yè)科學(xué) 2010年3期
    關(guān)鍵詞:耐高溫耐受性酵母菌

    彭源德,朱作華,唐守偉,嚴 理,溫 嵐,湯清明,熊和平

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,湖南 長沙 410205)

    石油作為國民經(jīng)濟發(fā)展的戰(zhàn)略物資在經(jīng)過人類近二百年的開采后,面臨全球枯竭的局面。特別是近年來,隨著經(jīng)濟的持續(xù)增長和石油需求迅速膨脹,我國已成為繼美國之后的第二大能源消費國。針對我國人多地少、糧食緊缺和石油短缺的國情,依據(jù)不與人爭糧、不與糧爭地,能源原料多元化,實現(xiàn)持續(xù)發(fā)展的原則,開發(fā)非糧燃料乙醇生物能源,降低生產(chǎn)成本,提高轉(zhuǎn)化效率,確?,F(xiàn)代社會發(fā)展的需求,已成為國家新能源戰(zhàn)略發(fā)展最緊迫的任務(wù)。傳統(tǒng)釀酒酵母的酒精發(fā)酵最適溫度不高,一般為25℃-30℃;耐酒性較差,耐酒精濃度在10%左右。一方面,在雜菌污染嚴重的情況下,生產(chǎn)上不僅要求無菌條件嚴格,操作難度較大,而且為了控制因發(fā)酵熱所引起的溫度上升,需要加入大量冷卻水(甚至在部分氣溫較高地區(qū),因發(fā)酵過程中過熱,根本無法進行正常生產(chǎn)),導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)成本增加[1-4];另一方面,酵母的耐酒精度較低,產(chǎn)物的抑制作用降低乙醇酵母的產(chǎn)乙醇潛力。因此,耐受性酒精酵母的選育研究已成為國內(nèi)外酒精行業(yè)的研究熱點[5-8]。從自然界中直接分離篩選耐高溫酒精酵母是育種工作中最經(jīng)濟適用的方法,國內(nèi)外不乏成功的例子[9-11]。

    本研究擬采用自然分離篩選與紫外誘變育種相結(jié)合的方法,獲得耐高溫、耐高濃度乙醇酵母菌,達到提高乙醇產(chǎn)率、減少燃料乙醇生產(chǎn)下游工程能耗和降低成本的目的。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌樣

    菌樣采自湖南、廣東、廣西和云南等四省(區(qū))的12縣(市),包括原始森林中的腐爛樹葉、劍麻土、甘蔗渣、酒醪、塘泥、污水、稍微腐爛的水果和蔬菜等;對照菌株(CK)為市售的丹寶利高溫活性干酵母。

    1.1.2 試劑和工藝輔料

    主要化學(xué)試劑有:無水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、TTC(三苯基四氮唑鹽酸鹽)、氫氧化鈉溶液、鹽酸和硫酸等,這些物質(zhì)均為市售商品。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    富集培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖),自然pH;種子培養(yǎng)液:YPD液體培養(yǎng)基;平板分離培養(yǎng)基:YPD瓊脂、PDA;初篩培養(yǎng)基:TTC上層培養(yǎng)基,TTC 0.05g、葡萄糖0.5g、瓊脂0.5g、加入100mL無菌水;TTC下層培養(yǎng)基,YPD瓊脂;發(fā)酵培養(yǎng)基(YFM):150g/L的葡萄糖,0.5%酵母膏,pH值5.0;斜面保藏培養(yǎng)基:YPD瓊脂。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品處理

    稱取固體菌樣30g左右,加入300mL無菌水中,120r/min搖10min,兩層紗布過濾,收集濾液備用;液體菌樣不處理,直接用于富集培養(yǎng)。

    1.2.2 富集培養(yǎng)

    取菌液10ml加入盛有富集培養(yǎng)基的錐形三角瓶中,添加適量的青霉素0.1‰-0.5‰抑制細菌的生長,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,再取1ml進行同條件傳代培養(yǎng),每2d接種繼代1次,3次繼代后進行分離純化。

    1.2.3 分離純化

    將稀釋的富集培養(yǎng)液,涂布于分離培養(yǎng)基平板上,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,挑取典型酵母菌落至YPD瓊脂斜面,編號、培養(yǎng),性能鑒定后將酵母菌劃線分純、保藏。

    1.2.4 酵母菌的初篩

    利用產(chǎn)酒精能力強的酵母菌能還原三苯基四氮唑鹽酸鹽(TTC)變?yōu)樯罴t色這一特性,篩選深紅色菌落。將分離得到的各菌株依次接入TTC下層培養(yǎng)基的平皿中,培養(yǎng)24h,長出菌落后倒入TTC上層培養(yǎng)基,30℃下保溫(陰暗處)2-3 h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力,初篩出產(chǎn)酒精能力強的酵母菌株,將酵母菌接種于YPD瓊脂斜面培養(yǎng)基中,低溫保藏。

    1.2.5 酵母菌的復(fù)篩

    將斜面菌種接一環(huán)于新鮮的種子培養(yǎng)液中,于30℃,170r/min搖床培養(yǎng)24h。按10%接種量將菌種接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基(YFM)的三角瓶中,于35℃培養(yǎng)箱,靜置發(fā)酵72h后測產(chǎn)氣情況和酒精含量。

    1.2.6 誘變育種

    以復(fù)篩后的酵母菌為始發(fā)菌,接種于種子培養(yǎng)液培養(yǎng)12h后,通過高溫(45℃)處理20min、調(diào)整菌懸液濃度為106個/ml,取5ml于無菌平皿中,進行紫外線處理(照射功率15w、照射距離20cm、照射時間10min、殺傷率在99.99%以上),然后對菌液進行分離、富培、純化和菌株表型特征觀察,菌體進行鏡檢。同時,對始發(fā)菌和誘變菌株進行乙醇發(fā)酵試驗,發(fā)酵液起始葡萄糖濃度200g/L。

    1.2.7 耐受性試驗

    一般采用500ml錐形瓶盛培養(yǎng)液200ml,起始糖度為150g/l,接種量5%,自然pH,置35℃恒溫靜止培養(yǎng)72h,以丹寶利耐高溫活性干酵母作對照,3次重復(fù)。根據(jù)研究目的設(shè)置的特定條件有:

    ①耐熱性:分別在30℃、35℃、40℃和45℃條件下發(fā)酵72h,測定發(fā)酵液的酒精濃度。

    ②耐乙醇能力:分別設(shè)置種子液的乙醇起始濃度為0%、4%、8%、12%、16%和20%,于35℃恒溫培養(yǎng)24h,觀察菌種生長,在660nm下測定培養(yǎng)液消光值(OD)。

    ③耐糖能力:分別設(shè)置發(fā)酵液糖的起始濃度為150g/l、200g/l、250g/l和300g/l,發(fā)酵72h,測定發(fā)酵液的酒精濃度。

    1.2.8 測定方法

    酒精濃度采用酒精比重計法測定[12]。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酒精酵母菌的篩選

    酒精酵母菌的分離與篩選結(jié)果列于表1,從表中看出,采集的22個菌樣中共分離出98個菌株,經(jīng)初篩,獲得12株酵母菌,占分離菌株的15.3%;酵母菌廣泛分布于4省(市)12個縣(市)的8類菌樣中;經(jīng)復(fù)篩,獲得4株(編號分別為:S11、S12、S15、S17)耐高溫的酒精酵母菌株,它們分別來自腐爛樹葉、甘蔗渣、劍麻土和酒醪等菌樣。

    從不同溫度下酵母菌的生長情況表2和表3可以看出,復(fù)篩出的4株酵母菌株均能在40℃下較好的生長,耐熱性能與對照菌株丹寶利耐高溫活性干酵母相當(dāng)。

    表1 酵母菌的分離與篩選結(jié)果Tab.1 Isolation and screeningofthermotolerant yeasts

    表2 不同溫度下菌落的生長情況Tab.2 Growth ofyeasts under different temperatures

    表3 不同溫度下酵母菌的吸光值Tab.3 ODvalues ofyeasts under different temperatures

    2.2 耐受性酵母菌的誘變育種

    為了進一步提高優(yōu)良菌株S15和S17發(fā)酵能力,對它們分別進行了高溫處理和紫外線誘變育種試驗,酵母菌誘變育種結(jié)果表4表明,高溫和紫外線處理對該2株菌的產(chǎn)酒精能力均有不同程度的提高;并獲得了1株產(chǎn)酒精能力比CK高12.6%的酵母菌株,編號為S132。

    表4 耐受性酵母菌誘變育種結(jié)果Tab.4 Ethanol tolerance comparison before and after mutant treatment

    2.3 菌落和菌體特征

    酵母菌在YPD瓊脂平板及種子培養(yǎng)液中生長特征如表5。表中結(jié)果顯示,酵母菌的菌落較濕潤,表面光滑,容易挑取,菌落質(zhì)地均勻,中間凸起,正反面以及邊緣與中間的顏色較一致,菌落顏色比較單調(diào),乳白色;液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為底部生長,不形成膜或環(huán);誘變處理獲得的菌株S132的菌落形態(tài)和菌體特征見圖1和圖2,具酵母菌的典型特征,其屬和種名有待于進一步鑒定。

    表5 酵母菌的菌落形態(tài)特征Tab.5 Colonycharacteristics ofthermotolerant yeasts

    圖1 S132的菌落形態(tài)Fig.1 Colonycharacteristic ofyeast S132

    圖2 S132的菌體特征Fig.2 Cytomorphological characteristic ofyeast S132

    2.4 耐受性初步鑒定

    2.4.1 耐高溫試驗

    表6列出了不同發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵性能的影響結(jié)果,由表6看出,3株菌株在30℃和36℃均具有良好的發(fā)酵性能;S132和S15在40℃仍具有一定的發(fā)酵活性,與CK相比,發(fā)酵液乙醇濃度分別提高20.9%和14%,說明是很有潛力的耐高溫酵母菌株。

    表6 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵性能的影響Tab.6 Influence oftemperature on fermentation abilityofyeasts

    2.4.2 耐乙醇試驗

    酵母菌在乙醇含量0-20%的YPD培養(yǎng)基中的生長情況見表7,從表中看出,四株酵母菌隨著培養(yǎng)基乙醇濃度的增加,菌數(shù)不斷減少,表明高濃度的乙醇含量會抑制酵母的生長繁殖。但S132對乙醇的耐受性大于對照,當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量為16%時,耐乙醇能力比對照高15%。

    表7 不同乙醇濃度培養(yǎng)的酵母菌液消光值Tab.7 ODvalues ofyeasts fermented under different ethanol concentrations

    2.4.3 耐糖性試驗

    酵母菌耐糖性試驗結(jié)果如表8。由表8看出,S132和S15的耐糖性能與對照相當(dāng),發(fā)酵液糖濃度由150g/L提高到200g/L時,乙醇濃度大幅度增加;糖濃度在200g/L至300g/L時,乙醇濃度變化不大。

    表8 發(fā)酵液起始糖濃度對酵母菌發(fā)酵性能的影響Tab.8 The effect ofstartingconcentration ofglucose on fermentation abilityofyeasts

    3 結(jié) 論

    采取自然分離篩選與誘變育種相結(jié)合的方法,是選育高耐受性酒精酵母經(jīng)濟適用的方法之一。通過本研究可以得出以下結(jié)論:①經(jīng)富集培養(yǎng),初篩、復(fù)篩,從22個菌樣中共分離獲得4株(編號分別為:S11、S12、S15、S17)耐高溫的酒精酵母菌株,它們分別來自腐爛樹葉、甘蔗渣、劍麻土和酒醪等菌樣;②對S15、S17進行誘變育種,獲得1株編號為S132的耐受性優(yōu)良酒精酵母;③選育獲得酵母菌的菌落較濕潤,表面光滑,容易挑取,菌落質(zhì)地均勻,中間凸起,正反面以及邊緣與中間的顏色較一致,菌落顏色比較單調(diào),乳白色;液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為底部生長,不形成膜或環(huán),具酵母菌的典型特征;④與對照丹寶利耐高溫酵母相比,S132耐受40℃高溫和乙醇的能力分別高出20.9%和15%,是一株良好的高耐受性酒精酵母。

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