環(huán)孢素眼用乳狀液的含量測(cè)定及穩(wěn)定性研究Δ

王延?xùn)|，唐細(xì)蘭，葉成添，吳 偉（中山大學(xué)中山眼科中心，廣州市 510060）

干眼癥是一種常見的眼表疾病，發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，治療不當(dāng)或延誤治療可形成角膜結(jié)膜瘢痕，最后角膜結(jié)膜失去光澤，角膜混濁導(dǎo)致失明，后果非常嚴(yán)重[1，2]。該癥常用的治療方案是局部應(yīng)用人工淚液，可改善患者的不適癥狀，但未能針對(duì)病因進(jìn)行治療。目前的研究[3]表明炎癥和細(xì)胞凋亡等因素共同參與了干眼癥的發(fā)病過程，而環(huán)孢素通過減少T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、下調(diào)炎癥因子及抑制淚腺和結(jié)膜上皮細(xì)胞的凋亡而成為近幾年來干眼癥防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4，5]。目前國(guó)內(nèi)外采用的環(huán)孢素眼局部制劑多存在眼內(nèi)通透性差、不穩(wěn)定、刺激性大等缺點(diǎn)而限制了此藥的臨床應(yīng)用。據(jù)此，筆者研制了低濃度的環(huán)孢素眼用乳狀液，用于干眼癥及其他眼部免疫性疾病的治療。為探討貯存條件對(duì)環(huán)孢素眼用乳狀液穩(wěn)定性的影響，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其含量，并用經(jīng)典恒溫加速法對(duì)該制劑的室溫貯存期進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀，包括G1314A紫外檢測(cè)器、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱、G1322A真空脫氣機(jī)、G1329A帶溫控自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；HH-420恒溫水箱（金壇市新一佳儀器廠）。

環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130495-200202，含量：98.8%）；0.05%環(huán)孢素眼用乳狀液（中山大學(xué)中山眼科中心制劑室提供，批號(hào)：090212，090218，090309）；乙腈和甲醇均為色譜純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件。色譜柱：Eclipse XDB-C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（67.5∶5∶27.5）；流速：0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：55 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液的制備。（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中含環(huán)孢素20 μg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。（2）樣品溶液。精密吸取0.05%環(huán)孢素眼用乳狀液2 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。（3）陰性樣品溶液。按處方比例稱取除環(huán)孢素外的其它基質(zhì)，按該制劑制備工藝制成眼用乳狀液，照“樣品溶液”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。在上述色譜條件下進(jìn)樣，分別記錄標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液以及陰性樣品溶液HPLC圖譜，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，環(huán)孢素的保留時(shí)間約為10.8 min，主藥峰與基質(zhì)峰分離良好，峰形尖而對(duì)稱，基質(zhì)不干擾環(huán)孢素的測(cè)定。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品25.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制備成質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40、50、60 mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取不同質(zhì)量濃度的環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，濾過，注入色譜儀，在上述色譜條件下記錄色譜，測(cè)定峰面積。將峰面積（A）與質(zhì)量濃度（C）作線性回歸，得環(huán)孢素的線性回歸方程為A＝119.6419C－18.4243（r＝0.9999）。結(jié)果表明，環(huán)孢素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5～60 mg·L－1。

圖1 高效液相色譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.樣品；C.陰性樣品；1.環(huán)孢素Fig 1 HPLC chromatogramA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.ciclosporin

2.1.5 精密度試驗(yàn)。按本品制劑處方，制備低、中、高（10、20、40 mg·L－1）3種濃度模擬內(nèi)容物，并于同日內(nèi)的不同時(shí)間和不同日分別進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度分別為0.12%、0.06%、0.06%，日間精密度分別為0.36%、0.23%、0.05%。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)。精密量取同一批號(hào)樣品6份，照“樣品溶液”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，分別精密吸取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果，環(huán)孢素含量的RSD＝0.29%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定其峰面積，計(jì)算得環(huán)孢素含量的RSD＝0.15%。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率試驗(yàn)。按本品制劑處方，制備低、中、高（10、20、40 mg·L－1）3種濃度模擬內(nèi)容物，每個(gè)濃度制備3份，分別測(cè)定其含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.1.9 樣品含量測(cè)定。按“樣品溶液”制備方法制備樣品溶液，搖勻，濾過，進(jìn)樣20 μL，分別測(cè)定批號(hào)為090212、090218、090309的3批樣品，結(jié)果，標(biāo)示含量分別為102.91%、98.79%、100.57%，RSD分別為0.40%、0.23%、0.16%。

2.2 經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)[6]

用HPLC法測(cè)得0.05%環(huán)孢素眼用乳狀液的初始標(biāo)示含量為100.57%，并定為100%。分別取5 mL該制劑分裝于消毒安瓿中，封口并置于恒溫水浴鍋中，分別于95℃、90℃、85℃、75 ℃條件下避光加熱，定時(shí)（0、24、48、72、96、120、144、168 h）取出并迅速冷卻終止反應(yīng)，取每一時(shí)間不同溫度下各3個(gè)樣品進(jìn)行分析，記錄色譜，峰面積積分后取平均值，計(jì)算標(biāo)示含量。與初始標(biāo)示含量相比，求出其相對(duì)百分含量。各溫度下不同時(shí)間點(diǎn)的環(huán)孢素含量結(jié)果見表2。

表2 經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)中環(huán)孢素相對(duì)百分含量變化（%）Tab 2 Relative percentage of ciclosporin in classic isothermal accelerated test（%）

以相對(duì)百分含量C的對(duì)數(shù)lgC對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，求出各溫度下的反應(yīng)速度常數(shù)（K值），見表3。

表3 各溫度下反應(yīng)速度常數(shù)K值結(jié)果Tab 3 Results of rate constant of reaction（K）at different temperatures

將各溫度下反應(yīng)常數(shù)的對(duì)數(shù)lgK對(duì)絕對(duì)溫度的倒數(shù)1/T進(jìn)行回歸處理，結(jié)果，lgK＝－4778.8088/T+10.2710（r＝0.9939），活化能（E）＝－（－4778.8088）×2.303×8.319＝91555.6 J·mol－1＝91.5556KJ·mol－1（E在41.8～125.4 KJ·mol－1時(shí)才適用加速試驗(yàn)）。由Arrhenius規(guī)律外推可得出25℃、40℃時(shí)的K值分別為1.7490×10－6、1.0247×10－5，預(yù)測(cè)環(huán)孢素眼用乳狀液在25℃的有效期t0.925℃＝2510.96 d（6.88年）；40℃的有效期t0.940℃＝428.58 d（1.17年）。

2.3 強(qiáng)光照射試驗(yàn)

將制劑在室溫（25±2）℃、光照強(qiáng)度（4500±500）Lx的條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，按眼用制劑穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，環(huán)孢素眼用乳狀液的性狀、色澤、pH值、含量等各項(xiàng)指標(biāo)均未見明顯變化。

3 討論

目前環(huán)孢素的含量測(cè)定雖然多采用HPLC法，但柱溫都要求較高，國(guó)外文獻(xiàn)多采用柱溫70～75℃，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)則多采用柱溫50～65℃，《中國(guó)藥典》二部[7]中測(cè)定環(huán)孢素原料也采用柱溫70℃。筆者采用上述這些色譜條件測(cè)定環(huán)孢素眼用乳狀液的含量，結(jié)果峰形大多較鈍，空白基質(zhì)又對(duì)主成分的測(cè)定有干擾?？紤]到柱溫過高會(huì)損害色譜柱的壽命，同時(shí)也為了更好地提高柱效，本研究建立和改良了環(huán)孢素的HPLC檢測(cè)方法，經(jīng)回收率和精密度試驗(yàn)證實(shí)，采用該色譜條件測(cè)定環(huán)孢素眼用乳狀液的含量，峰形較好，主峰窄而尖，主成分峰與其它峰分離較好，靈敏度高，專一性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，回收完全，可以有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

考察藥物在室溫情況下放置至質(zhì)量指標(biāo)不合格所經(jīng)歷的時(shí)間為留樣觀察法所測(cè)得的藥物貯存期。這個(gè)方法切合實(shí)際，所得貯存期結(jié)果準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)，尤其對(duì)于新藥、新制劑的篩選和考察尤為不便；而應(yīng)用化學(xué)動(dòng)力學(xué)中濃度影響反應(yīng)速度的基本規(guī)律及溫度影響反應(yīng)速度的基本規(guī)律可以推測(cè)出藥物的貯存期[6]。根據(jù)這一原理，本研究采用經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)來預(yù)測(cè)環(huán)孢素眼用乳狀液的有效期。對(duì)該制劑的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，該制劑在室溫條件下穩(wěn)定，在25℃貯存的有效期為6.88年，40℃貯存的有效期為1.17年。而且強(qiáng)光照射試驗(yàn)也顯示，光照對(duì)該制劑的穩(wěn)定性未見明顯影響，所以無需避光保存，在室溫下就可保存。

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[6]龐貽慧，曾純素.藥物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1984：35.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：306.