RP-HPLC法測(cè)定施普睿達(dá)原料藥中主藥的含量Δ

徐 陽，劉培勛，禹 潔，王育苗，龍 偉，馬世堂

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，放射醫(yī)學(xué)研究所，天津分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市 300192）

豆科槐屬植物體內(nèi)含有為數(shù)不少的具有生物活性的生物堿，其中部分生物堿具有一定的抗腫瘤作用[1]。施普睿達(dá)是豆科槐屬植物生物堿經(jīng)半合成得到的抗腫瘤生物堿衍生物。建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行方法的驗(yàn)證是進(jìn)行抗腫瘤藥效學(xué)研究的保證。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，筆者建立了用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定施普睿達(dá)含量的有關(guān)方法。該方法系統(tǒng)適用性好、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，適合施普睿達(dá)的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

Alliance 2695 HPLC儀，包括Empower工作站、PDA 2998檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；AUY220電子分析天平（日本島津公司）；PB-10pH儀（德國(guó)Sartorius公司）。

施普睿達(dá)對(duì)照品（批號(hào)：2009224，用3種不同流動(dòng)相、經(jīng)面積歸一化法測(cè)定，純度均大于99.0%；并經(jīng)3種不同展開劑薄層色譜結(jié)果鑒定）和供試樣品施普睿達(dá)原料藥（批號(hào)：2009316、2009319、2009409；面積歸一化法測(cè)定純度分別為99.0%、95.2%、97.5%）均為本所自制；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMRP C18（500 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（pH＝3.01）∶乙腈＝9∶1；流速：1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；在上述色譜條件下，按施普睿達(dá)峰面積計(jì)算理論塔板數(shù)不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備。精密稱取施普睿達(dá)對(duì)照品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相制成濃度為1 mg·mL－1的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備。精密稱取施普睿達(dá)供試品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相制成濃度為1 mg·mL－1的供試品溶液，備用。

2.3 方法專屬性的考察[2]

2.3.1 施普瑞達(dá)與起始原料以及中間產(chǎn)物的分離。精密稱取施普瑞達(dá)對(duì)照品5 mg、原料槐定堿5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容。進(jìn)樣10 μL，記錄保留時(shí)間。精密稱取施普瑞達(dá)對(duì)照品5 mg、中間產(chǎn)物奧賽博思5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容。分別進(jìn)樣10 μL，記錄保留時(shí)間。結(jié)果見圖1。

由圖1可見，各化合物均能有效分離。

圖1 高效液相色譜圖A.施普瑞達(dá)對(duì)照品；B.供試品；C.施普瑞達(dá)+槐定堿；D.施普瑞達(dá)+奧賽博思；1.施普瑞達(dá)；2.槐定堿；3.奧賽博思Fig 1 HPLC chromatogramA.Sprida control；B.test sample；C.Sprida spiked with sophoridine；D.Sprida spiked with aosaibos；1.Sprida；2.sophoridine；3.aosaibos

2.3.2 降解試驗(yàn)。稱取4 mg施普睿達(dá)供試品，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，放置在170℃的干燥箱內(nèi)，5 h后，加入10 mL流動(dòng)相溶解，作為高溫破壞溶液；稱取4 mg施普睿達(dá)供試品置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，分別滴加35%的濃鹽酸3滴靜置2.5 h，或滴加6 mol·L－1的NaOH溶液3滴靜置1.5 h，或滴加30%雙氧水5滴加熱1 h，之后各樣品加入流動(dòng)相稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，作為酸、堿、氧化破壞溶液。稱取4 mg施普睿達(dá)供試品置于10 mL透明容量瓶，在光照（4500±500）Lx下放置20 d后，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為光破壞溶液。取上述5種溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，各種條件下降解產(chǎn)物與施普瑞達(dá)分離度良好。各溶液色譜見圖2。

圖2 施普瑞達(dá)降解產(chǎn)物高效液相色譜圖A.高溫破壞溶液；B.酸破壞溶液；C.堿破壞溶液；D.氧化破壞溶液；E.光破壞溶液；1.施普瑞達(dá)Fig 2 HPLC chromatogram of degradation products of SpridaA.treated with high temperature；B.treated with acid；C.treated with alkali；D.treated with oxidation；E.treated with light；1.Sprida

2.4 線性范圍

精密量取對(duì)照品溶液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.1 mL分別置于10、10、10、10、10、25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得一系列對(duì)照品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜。以施普睿達(dá)濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝4×106X+1756.8（R2＝0.9999）。結(jié)果表明，施普睿達(dá)檢測(cè)濃度線性范圍為0.004～0.5 mg·mL－1。

2.5 最低檢測(cè)限

取對(duì)照品溶液適量加流動(dòng)相稀釋成一定濃度的溶液，測(cè)定，以信噪比3倍計(jì)算的施普睿達(dá)的最低檢測(cè)限為8 ng；以信噪比10倍計(jì)算的施普睿達(dá)的最小定量限20 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品貯備液5 mL，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定施普睿達(dá)峰面積，計(jì)算其RSD＝0.23%。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相稀釋至刻度，同時(shí)，在24 h內(nèi)每2 h進(jìn)樣1次測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算得RSD＝0.45%。結(jié)果表明該供試品溶液穩(wěn)定，能滿足測(cè)定要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批施普睿達(dá)供試品分6次取樣，精密稱定5 mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋成0.5 mg·mL－1溶液，按上述色譜條件測(cè)定，6次測(cè)定結(jié)果的含量平均RSD值為2.63%，結(jié)果表明該法重復(fù)性好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密量取1 mg·mL－1供試品1 mL，共10份，置于10 mL容量瓶中，分別精密量取對(duì)照品（1 mg·mL－1）貯備液0.5、1、1.5 mL各3份，置于加入供試品的容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按上述色譜條件測(cè)定。測(cè)得樣品峰面積，求得回收率，結(jié)果其平均回收率為100.0%，RSD＝1.25%，詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

在上述色譜條件下，精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，記錄色譜，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品的含量。結(jié)果，批號(hào)為2009316、2009319、2009409的施普瑞達(dá)標(biāo)示含量分別為99.20%、95.30%、97.54%。

3 討論

本試驗(yàn)曾考察了組成為冰醋酸-乙腈，以及不同濃度、不同pH的磷酸鹽緩沖液-乙腈組成的流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜行為，最后確定本文所用的流動(dòng)相，并證實(shí)在該條件下所得色譜峰形好，分離度符合要求；同時(shí)，所選用的色譜柱普遍、通用，方便推廣。

[1]洪 閣，劉培勛.槐屬植物生物堿化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2005，36（5）：783.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄172.