G蛋白抑制肽GCIP-27對小鼠心肌肥大的影響Δ

盧小嵐，楊華，鄧翔，劉雅，李曉輝，張海港（第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室暨新藥研究中心，重慶市 400038）

心肌肥大是高血壓、冠心病、瓣膜病及先天性心臟病等多種心血管疾病的常見并發(fā)癥，是心肌細(xì)胞對多種病理刺激的一種共同反應(yīng)。近年來，心肌肥大作為一種引起心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著升高的獨立危險因素和重要原因[1]，引起了人們的廣泛重視和高度關(guān)注，逆轉(zhuǎn)心肌肥大已成為當(dāng)前治療高血壓及慢性充血性心力衰竭的重要目標(biāo)之一。

第三軍醫(yī)大學(xué)藥劑教研室暨新藥研究中心在既往工作中，針對在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的Gq蛋白α亞單位克隆制備出一種G蛋白抑制性多肽（G protein inhibitory peptide，GCIP）[2]，并從分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面對其進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計，獲得了一種能夠顯著抑制體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)的優(yōu)化分子GCIP-27[3]。本研究擬從整體水平觀察GCIP-27對去甲腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 試藥

GCIP-27（采用固相方法合成，北京中科亞光科技公司，批號：C271401，純度：96%）；重酒石酸去甲腎上腺素（美國Serva公司，批號：L11386，純度：98%）；抗壞血酸（上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站，批號：970401，純度：99%）；酒石酸鉀鈉（重慶川東化工公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）和免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司；抗c-Fos抗體和抗p-ERK1/2抗體（美國Santa Cruz公司）；濃縮型DAB顯色試劑盒和抗體稀釋液（武漢博士德公司）。

1.2 動物

健康清潔級小鼠50只，體質(zhì)量（BW）20～24 g，♀♂各半，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物實驗合格證號：SCXK（渝）20020003。

忠誠、干凈、擔(dān)當(dāng)是領(lǐng)導(dǎo)干部的核心素質(zhì)，勇于擔(dān)當(dāng)，就是要有強烈的責(zé)任意識，在其位，謀其政，高標(biāo)準(zhǔn)的履職盡責(zé)。動力廠強化擔(dān)當(dāng)意識，推動崗位實踐融入中心工作。結(jié)合“四合格四詮釋”崗位實踐，廣大黨員干部銳意進(jìn)取，攻堅克難，在大項目改造、裝置檢修搶修、優(yōu)化生產(chǎn)運行、節(jié)能降耗等工作中，奉獻(xiàn)擔(dān)當(dāng)，用實際行動踐行“四合格”，做到“五帶頭”，干部員工隊伍奮發(fā)有為、敬業(yè)履職，圓滿完成生產(chǎn)經(jīng)營任務(wù)，不斷開創(chuàng)各項工作新局面，推動企業(yè)發(fā)展取得新成效。

1.3 動物分組及模型建立

但是文獻(xiàn)[12]方案中尚存在不足：沒有考慮里層節(jié)點剩余能量小于能量閾值的情況以致網(wǎng)絡(luò)節(jié)點存活率低；小車在各方環(huán)的充電時間僅考慮節(jié)點平均消耗能量，節(jié)點剩余能量的均衡性可以進(jìn)一步增強.針對上述不足，本文提出一種射頻能量捕獲網(wǎng)絡(luò)移動能量源均衡化充電策略，首先將區(qū)域劃分為六邊形網(wǎng)格，將六邊形的中心點作為小車移動過程中的停留點，將傳感器節(jié)點分層，給定能量源移動路徑，基于機會路由提出一種分配小車充電時間的算法，滿足相鄰兩層網(wǎng)絡(luò)節(jié)點剩余能量方差最小以實現(xiàn)節(jié)點能量的最大均衡化需求.本文的主要貢獻(xiàn)如下：

1.4 心肌肥大指標(biāo)的測定[4]

小鼠心肌肥大指標(biāo)測定完畢后，將左心室組織置于10%福爾馬林中固定24 h；石蠟包埋，切片。免疫組化采用SP法。切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，復(fù)合消化液消化20 min后加正常山羊血清封閉30 min。加一抗4℃過夜。次日復(fù)溫至37℃、1 h，滴加二抗工作液37℃、30 min，滴加鏈霉卵白素37℃、30 min，DAB顯色。以上步驟間均用0.01 mol·L－1PBS洗滌5 min×3次。蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。c-Fos的表達(dá)情況用陽性細(xì)胞率表示，光鏡下隨機選擇視野，分別計數(shù)細(xì)胞核總數(shù)與陽性細(xì)胞總數(shù)，二者比值為陽性細(xì)胞率。p-ERK1/2的表達(dá)采用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（Image-proplus 4.5）進(jìn)行半定量分析。所有玻片均在同一放大倍數(shù)、同一光強度下分析，測量相同面積的平均光密度值。

本文摸索了一種專業(yè)論文文本大數(shù)據(jù)的挖掘方法，采用雙關(guān)鍵詞搜索，以論文標(biāo)題為源數(shù)據(jù)，經(jīng)過分詞、詞頻排序、專業(yè)論文中日常用詞語料庫匹配排除，得出有效專業(yè)詞匯列表。再通過人工方法對專業(yè)詞匯歸類，歸納出各級評價因子。并對詞頻頻率值進(jìn)行統(tǒng)計計算，得出各評價因子權(quán)重，進(jìn)而得到完整的評價體系表。

1.5 免疫組化檢測[5]

末次給藥后第2天，稱量小鼠BW后，頸椎脫臼處死，迅速開胸取出心臟，冰冷生理鹽水洗去血跡，濾紙吸干，天平稱量心臟重（HW）；小心去除心房和右心室（保留室間隔），稱量左心室重（LVW）；以左室重與體質(zhì)量之比作為左心室指數(shù)（LVI），即心肌肥大指數(shù)；以全心重與體質(zhì)量之比作為心臟指數(shù)（HI）；并計算左心室重/心臟重（LVW/HW）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

各組小鼠各心肌肥大指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。

由表1、圖1、圖2可見，對照組小鼠心肌組織中很少表達(dá)c-Fos，p-ERK1/2也僅有少量表達(dá)。與對照組比較，模型組的c-Fos表達(dá)明顯增強，陽性細(xì)胞率達(dá)（51.3±6.7）%；p-ERK1/2表達(dá)也明顯增強（P＜0.01）。經(jīng)GCIP-27處理后，3個GCIP-27劑量組c-Fos和p-ERK1/2表達(dá)量均顯著減少（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 GCIP-27對小鼠心肌肥大的影響

表1 各組小鼠心肌肥大指標(biāo)檢測結(jié)果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

表1 各組小鼠心肌肥大指標(biāo)檢測結(jié)果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.NA group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量/μg·kg－1n BW/g HW/mg LVW/mg HI/mg·g－1LVI/mg·g－1LVW/HW/%對照組模型組GCIP-27組GCIP-27組GCIP-27組——1010301008 9 8 825.1±2.1923.2±1.6923.9±2.2423.5±2.0023.1±2.2698.8±9.68112.1±12.1＊101.0±13.398.6±18.8#95.2±5.79#70.8±8.2185.6±9.16＊＊73.4±10.2##71.3±14.6##67.9±6.30##3.95±0.314.82±0.44＊＊4.22±0.32##4.18±0.54##4.17±0.52##2.82±0.273.69±0.36＊＊3.06±0.21##3.02±0.44##2.98±0.48##71.6±.3.676.5±4.1＊72.7±2.4#72.3±4.4#71.2±30#

各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK1/2表達(dá)定量結(jié)果見表2，各組小鼠心肌組織c-Fos蛋白表達(dá)情況見圖1，p-ERK1/2表達(dá)情況見圖2。

取小鼠50只隨機分為對照組、模型組和GCIP-27（10、30、100 μg·kg－1，劑量選取參考文獻(xiàn)[2]）組（n＝10）。對照組給予0.1%抗壞血酸/0.003%酒石酸鉀鈉/生理鹽水；模型組給予0.1%抗壞血酸/0.006%重酒石酸去甲腎上腺素/生理鹽水（相當(dāng)于去甲腎上腺素1.5 mg·kg－1）；GCIP-27組在給予去甲腎上腺素的同時，按照預(yù)實驗結(jié)果，給予GCIP-2710、30、100 μg·kg－1，各組給藥體積均為50 mL·kg－1，腹腔注射（ip），1日2次，連續(xù)15 d。

2.2 GCIP-27對小鼠肥大心肌組織c-Fos和p-ERK1/2表達(dá)的影響

在整個實驗期間，模型組和GCIP-27低、中、高劑量組小鼠分別死亡2、1、2、2只，各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。各組小鼠BW之間比較無顯著性差異。與對照組比較，模型組小鼠HW、LVW、LVI、HI、LVW/HW均明顯增加。說明在本實驗條件下，應(yīng)用GCIP-27各劑量后均能明顯抑制小鼠心肌肥大，除低劑量組HW（減輕9.9%，但P＞0.05）外，各劑量組的其它各項心肌肥大指標(biāo)均有顯著改善，尤其是特異性反映心肌肥大的LVI，與模型組比較顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK 1/2表達(dá)定量結(jié)果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

表2 各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK 1/2表達(dá)定量結(jié)果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.NAgroup：#P＜0.01

組別對照組模型組GCIP-27組GCIP-27組GCIP-27組p-ERK1/2表達(dá)量（光密度值）0.136±0.0180.307±0.054＊0.250±0.033#0.209±0.037#0.188±0.029#劑量/μg·kg－1n——1010301008 9 8 8 c-Fos表達(dá)量（陽性細(xì)胞率/%）2.6±3.051.3±6.7＊32.0±5.8#22.9±5.4#17.6±3.1#

圖1 各組小鼠心肌組織c-Fos蛋白表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）A.對照組；B.模型組；C.GCIP-27中劑量組Fig1 The expression of c-Fos in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

圖2 各組小鼠心肌組織p-ERK1/2表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）A.對照組；B.模型組；C.GCIP-27中劑量組Fig 2 The expression of p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

2.2 乳酸水平比較 入組時兩組患者間乳酸水平相似，分別為(6.31±0.78) mmol/L和(6.13±0.62) mmol/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過治療后兩組乳酸水平均有下降，且實驗組下降得更為明顯，到治療后第1 d、第3 d兩組乳酸水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

心肌肥大主要是心肌細(xì)胞體積增大的結(jié)果，即直徑增寬，長度增加；同時，心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加，DNA、RNA以及蛋白質(zhì)合成加強，所以心肌總量很快增長，導(dǎo)致整個心臟重增加，尤其是左心室重增加顯著。雖然心肌肥大早期有一定的代償作用，但增生的心肌組織最終造成心肌供血供氧不足，能量生成減少，心肌收縮性減弱。

So L5=950×I6+475+475-200=950×I6+750,L6=Ls-A1-A2-220-200-(950×I6+750)=Ls-A1-A2-950×I6-1 170

c-Fos是一種DNA結(jié)合蛋白，在核內(nèi)起信使作用，將膜信號引發(fā)的胞漿事件與核內(nèi)的基因活動聯(lián)系起來；與心肌細(xì)胞的生長、發(fā)育亦密切相關(guān)，在胚胎期心肌表達(dá)較高，出生后1周便消失。當(dāng)心肌負(fù)荷增加或促心肌生長因素刺激時，早期常伴有c-Fos等原癌基因產(chǎn)物的有序表達(dá)，而后才出現(xiàn)心肌肥大[6]。c-Fos是組成由細(xì)胞表面刺激到出現(xiàn)相應(yīng)的細(xì)胞效應(yīng)的信息傳遞鏈的成分，在心肌肥大的反應(yīng)中起著一種允許作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。ERK（Extracellular signal regulated kinase）是一族分子量為40～60 KD的蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，可對許多細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)而被快速激活。p-ERK1/2是ERK1/2的活化形式，ERK1/2活化為p-ERK1/2后，轉(zhuǎn)位入核，可磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白，如c-Fos、c-myc、STAT等[7]，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。

在心肌肥大的發(fā)生過程中，鳥苷酸結(jié)合蛋白Gq蛋白處于樞紐地位，去甲腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1、神經(jīng)肽Y等通過其相應(yīng)的受體與Gq蛋白相偶聯(lián)[8]。Gq活化后，激活磷脂酶C，繼而催化磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸（PIP2）水解生成1，4-三磷酸肌醇與二?；视?，前者引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，后者激活蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）。PKC與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化有關(guān)，能促進(jìn)多種蛋白質(zhì)分子中絲氨酸或蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應(yīng)，促進(jìn)基因表達(dá)，刺激細(xì)胞的增殖，是肥大信號傳遞的共同通路之一，在肥大反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

GCIP-27是Gq蛋白α亞單位的蛋白羧基末端模擬肽，通過與受體結(jié)合阻礙鳥氨酸調(diào)節(jié)蛋白Gα蛋白分子效應(yīng)，從而拮抗多種受體激動劑的功能，具有比拮抗單一受體更強的作用。本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)，合成肽GCIP-27能明顯減小去甲腎上腺素或血管緊張素Ⅱ刺激的體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的直徑、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率。本實驗發(fā)現(xiàn)，GCIP-27能夠明顯減小去甲腎上腺素所誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大，抑制心肌組織中p-ERK1/2表達(dá)，降低原癌基因c-Fos表達(dá)。說明GCIP-27不僅能在體外抑制心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)，在整體情況下同樣具有顯著的抗心肌肥大作用，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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