十字花科植物中主要硫代葡萄糖苷合成與調(diào)節(jié)基因的研究進(jìn)展

程 坤 楊麗梅 方智遠(yuǎn) 劉玉梅 莊 木 張揚勇 孫培田

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GS，簡稱硫苷）又稱芥子油苷，是一種含氮、硫的重要植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于十字花科植物中，如白菜、甘藍(lán)、油菜、芥菜、花椰菜、蕪菁、蘿卜等，并且所有的十字花科植物都能合成硫苷（廖小軍 等，1999；Halkier & Gershenzon，2006）。

硫苷都具有相同的基本結(jié)構(gòu)，包括含糖基團(tuán)、硫酸鹽基團(tuán)和可變的非糖側(cè)鏈（R）各一個。根據(jù)R的不同，可將其分成脂肪族（Aliphatic）、芳香族（Aromatic）和吲哚族（Indolyl）三類（Mithen，2001；李鮮 等，2006）。硫苷一般貯存于植物細(xì)胞液泡中，而硫代葡萄糖苷酶（通常稱芥子酶）則位于特定的蛋白體中，在正常情況下，兩者是分離的，相對穩(wěn)定。當(dāng)植物組織受到機(jī)械損傷或者昆蟲侵害時，細(xì)胞的代謝區(qū)隔被破壞，硫苷與芥子酶相遇而發(fā)生水解反應(yīng)，生成異硫氰酸鹽（Isothiocyanates）、硫氰酸脂（Thiocyanates）和腈類（Nitriles）等降解產(chǎn)物（汪俏梅和曹家樹，2001；鄭建仙，2005）。硫苷與這些降解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，如參與植物防衛(wèi)反應(yīng)、刺激昆蟲取食、預(yù)防癌癥發(fā)生、賦予植物特殊風(fēng)味等（陳亞洲和閻秀峰，2007；申樹芳 等，2009），因而硫苷引起了植物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)、食品科學(xué)等眾多領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。近年來，隨著在模式植物擬南芥上研究的深入，人們已經(jīng)確定了硫苷生物合成的大部分中間產(chǎn)物，而硫苷的主要合成基因和調(diào)節(jié)基因也得到了證實，比如MYB、MAM、CYP79/CYP83、AOP等基因家族都在硫苷合成的不同階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用（汪俏梅和曹家樹，2001；鐘海秀 等，2007）。

1 十字花科植物中硫代葡萄糖苷的生物學(xué)功能

硫苷在十字花科植物的生活周期中起著重要的作用，但它在生物學(xué)上是相對惰性的，有時要靠它的降解產(chǎn)物異硫氰酸鹽等來發(fā)揮生理功效。硫苷及其降解產(chǎn)物能參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)，起抗蟲、抗病等作用。硫苷及其降解產(chǎn)物對昆蟲有毒，它們通過減少昆蟲體內(nèi)總氧氣的吸入和CO2的呼出，抑制了糖酵解-克雷布斯循環(huán)，從而改變昆蟲的新陳代謝能力，導(dǎo)致昆蟲生長緩慢甚至死亡（Pracros et al.，1992；陳亞洲和閻秀峰，2007）。另一方面，硫苷及其降解產(chǎn)物在害蟲與植物的識別中發(fā)揮作用，一些揮發(fā)性的異硫氰酸鹽可作為攝食或產(chǎn)卵的刺激物吸引十字花科植物害蟲。異硫氰酸鹽對多種病原體、細(xì)菌、真菌都具有毒害作用，比如吲哚類硫苷及其降解產(chǎn)物與十字花科植物中危害最大的真菌性病害根腫病的發(fā)育有關(guān)（Ludwig-Müller et al.，1999；汪俏梅和曹家樹，2001）。異硫氰酸鹽具有抗癌功能，通過雙重機(jī)制來特異性地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝，即選擇性使階段Ⅰ酶失活（例如細(xì)胞色素P450酶）和誘導(dǎo)階段Ⅱ酶（例如苯醌還原酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的代謝途徑，抑制癌細(xì)胞的分裂和生長（Fahey et al.，1998；鄭建仙，2005）。異硫氰酸鹽還能使十字花科蔬菜產(chǎn)生不同的特殊風(fēng)味，如白菜類的清鮮味、蘿卜的辛辣味等（黃界潁和馬友華，2003；徐東輝，2007）。硫苷及其降解產(chǎn)物能調(diào)節(jié)十字花科植物的生長素代謝，平衡體內(nèi)的硫元素，緩解硫素脅迫，保證植物正常生長發(fā)育，這些生物學(xué)功能對植物、動物和人類都具有生物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的重要意義（黃界潁和馬友華，2003；鄭建仙，2005）。

2 十字花科植物中硫代葡萄糖苷主要合成與調(diào)節(jié)基因

由于硫苷具有獨特的生物學(xué)功能，人們對硫苷的合成途徑進(jìn)行了大量的研究。硫苷生物合成模式大致可分為三個階段（圖1）：氨基酸側(cè)鏈的延長、硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成和葡萄糖配基側(cè)鏈的二次修飾（李娟和朱祝軍，2005；Hirai et al.，2007）。隨著模式植物擬南芥基因組的序列測定和功能解析，通過體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，人們對硫苷的生物合成途徑有了較為深入的了解。研究發(fā)現(xiàn)，所有的硫苷都是由氨基酸合成而來，脂肪族硫苷來源于甲硫氨酸，芳香族硫苷來源于苯丙氨酸，吲哚族硫苷來源于色氨酸。油菜（Brassica napus L.）的雜交選育試驗證明，植物硫苷的含量受上代基因型的影響，硫苷含量高的植株其子代含量也高，這說明硫苷的有無與含量的高低是由基因來控制的，目前在硫苷合成的三個階段中，相關(guān)的主要合成和調(diào)節(jié)基因已得到了驗證，分別是由MAM、CYP79/CYP83、AOP等合成基因家族起決定作用（鄭建仙，2005；周榮漢和段金廒，2005），而轉(zhuǎn)錄因子MYB基因家族在硫苷的生物合成過程中則起著調(diào)節(jié)上述基因的作用（Yan & Chen，2007）。

2.1 MYB基因家族

圖1 硫代葡萄糖苷生物合成途徑及主要合成與調(diào)節(jié)基因

MYB是一類轉(zhuǎn)錄因子基因，也是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一（Martin & Paz-Ares，1997），能在轉(zhuǎn)錄水平上通過調(diào)節(jié)與其合成相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控硫苷的合成。其中，MYB28、MYB29和MYB76能夠調(diào)控脂肪族硫苷的合成，MYB34、 MYB51和MYB122能夠調(diào)節(jié)吲哚族硫苷的合成，它們經(jīng)過激素或受傷誘導(dǎo)后的過量表達(dá)能夠分別引起植株體內(nèi)脂肪族硫苷和吲哚族硫苷的增加（Gigolashvili et al.，2007b；Hirai，2009）。MYB28基因是脂肪族硫苷合成的一個正調(diào)控因子，也是關(guān)鍵因子，調(diào)控從甲硫氨酸到脂肪族硫苷的通路，能夠激活脂肪族硫苷合成途徑的相關(guān)基因，包括 MAM1、MAM3、CYP79F1、CYP79F2、CYP83A1、AtST5b、AtST5c等，但不能影響吲哚族硫苷生物合成的基因，包括 CYP79B2、CYP79B3等。Gigolashvili等（2007b）利用擬南芥MYB28過表達(dá)和敲除該基因的植株證明了植物體內(nèi)硫苷積累量的升高或降低與MYB28的轉(zhuǎn)錄正相關(guān)。該基因也是脂肪族硫苷合成時本底水平調(diào)節(jié)所必須的，它的表達(dá)能夠被機(jī)械刺激非常迅速地誘導(dǎo)，可引起脂肪族硫苷水平的升高。MYB28基因能夠調(diào)控 AOP2基因，但是不能調(diào)控 AOP3基因（Gigolashvili et al.，2007a；Hirai et al.，2007）。MYB29在茉莉酸甲酯介導(dǎo)的脂肪族硫苷生物合成過程中起附帶作用。MYB51基因能夠被機(jī)械刺激（如觸摸或受傷）誘導(dǎo)后過量表達(dá)，但是 MYB34基因不具備此特性。MYB51基因的過表達(dá)能夠調(diào)控吲哚族硫苷生物合成途徑中的基因，如 CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、UTG74B1、AtST5a等，引起植物體內(nèi)吲哚族硫苷的增加（Gigolashvili et al.，2007a；Gigolashvili，2009）。

2.2 MAM基因家族

甲硫烷基化蘋果酸合成酶（Methylthioalkylmalate synthase）基因（MAM）家族是控制甲硫氨酸起源的脂肪族硫苷側(cè)鏈延長的一類主要合成基因（Kroymann et al.，2001，2003；Textor et al.，2007）。這些年來，在蕓薹屬栽培種和擬南芥中都已鑒定出控制甲硫氨酸側(cè)鏈延長的GS-elong位點（Magrath et al.，1994；Mithen & Campos，1996）。在擬南芥 Landsberg erecta 生態(tài)型與 Columbia生態(tài)型的重組自交系中，從 GS-elong位點的 QTL圖譜鑒別出 2個基因 MAM1和 MAM2（de Quiros et al.，2000；Wittstock & Halkier，2002），其中MAM1基因是控制甲硫氨酸起源的脂肪族硫苷側(cè)鏈延長的主要基因，它調(diào)控甲硫氨酸側(cè)鏈延長過程中的第1和第2個縮合反應(yīng)，能夠編碼甲硫烷基化蘋果酸合成酶，催化甲硫氨酸鏈的 1～2個亞甲基由單同源甲硫氨酸延長為雙同源甲硫氨酸，從而形成帶有3～4個碳側(cè)鏈的脂肪族硫苷（Kroymann et al.，2001），來自擬南芥Columbia生態(tài)型的MAM1基因有上述功能，然而來自Landsberg erecta生態(tài)型的MAM1基因卻沒有表現(xiàn)此活性，這也解釋了擬南芥不同生態(tài)型間硫苷結(jié)構(gòu)的差異性（Wittstock & Halkier，2002）。MAM2基因僅能催化甲硫氨酸側(cè)鏈延長的第1個縮合反應(yīng)，形成同源甲硫氨酸（Kroymann et al.，2003）。另外，在擬南芥兩個生態(tài)型Cvi×Ler群體中，通過QTL圖譜鑒定出的MAM3基因能催化甲硫氨酸側(cè)鏈延伸的全部6個循環(huán)并使得甲硫氨酸生成短側(cè)鏈和長側(cè)鏈（Textor et al.，2007）。

2.3 CYP79/CYP83基因家族

目前，硫苷核心結(jié)構(gòu)形成過程中的中間化合物已被確定，主要包括N-羥基氨基酸、乙醛肟、硫代肟基酸和脫硫硫苷，都是形成硫苷的前體。研究發(fā)現(xiàn)，多功能酶細(xì)胞色素 P450（CYP450）能夠催化氨基酸轉(zhuǎn)化為乙醛肟，這一反應(yīng)是硫苷合成過程中的關(guān)鍵步驟（Hull et al.，2000；鐘海秀 等，2007；Zang et al.，2008）。在模式植物擬南芥中已成功鑒定出細(xì)胞色素 P450的同族物CYP79，其中CYP79家族7個有功能的同族體中也已有5個在擬南芥的硫苷合成中得到確認(rèn)，它們都能催化氨基酸形成乙醛肟，而乙醛肟是形成硫苷的前體。不同的同族體具有不同的底物專一性，其中 CYP79A2催化的底物是苯丙氨酸，能形成芳香族乙醛肟，CYP79B2和 CYP79B3能夠催化色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?3-吲哚-乙醛肟（Indole-3-acetaldoxime，IAOx），CYP79F1和 CYP79F2催化甲硫氨酸衍生物側(cè)鏈的延長，控制脂肪族乙醛肟合成。另外細(xì)胞色素 P450家族中的 CYP83A1和CYP83B1都與乙醛肟代謝酶有關(guān)，都能將乙醛肟轉(zhuǎn)變成硫苷，但是CYP83A1僅對脂肪族乙醛肟具有高親和性，而 CYP83B1對吲哚族乙醛肟和芳香族乙醛肟都具有高親和性?？傊?，已經(jīng)證實CYP家族的同族物在三類硫苷的合成中都對乙醛肟的形成有作用（Du et al.，1995；Rosa et al.，1997；Mikkelsen et al.，2002；鐘海秀 等，2007）。另外，CYP同族體的鑒定也為硫苷結(jié)構(gòu)的代謝提供了重要工具（Mikkelsen et al.，2002）。同時，既然硫苷是源于氨基酸的含氮和含硫的葡萄糖苷，筆者預(yù)期其生物合成途徑與初生代謝途徑密切相關(guān)。當(dāng)?shù)蛄虼x受影響時，硫苷代謝也會受到影響（Hirai et al.，2007；Schonhof et al.，2007a，2007b），當(dāng) CYP79F1或 CYP79F2突變或共抑制后，甲硫氨酸底物會富集到很高的水平（Hansen et al.，2001），這說明由甲硫氨酸到硫苷的合成途徑中，CYP家族的基因起到了重要作用。

2.4 AOP基因家族

硫苷側(cè)鏈的二次修飾一般被認(rèn)為是硫苷合成過程中的最后一步，包含了羥化、甲基化、氧化和去飽和等，這是導(dǎo)致硫苷種類較為豐富的原因（汪俏梅和曹家樹，2001；Grubb & Abel，2006）。在硫苷的二次修飾過程中，要受到基因位點 AOP（2-Oxoglutarate-Dependent Dioxygenases）基因家族的調(diào)控，在這個位點上含有 3個等位基因，即 GS-ALK、GS-OHP和GS-Null（GS-ALK和GS-OHP為緊密連鎖位點，可統(tǒng)稱為GS-AOP），其中GS-ALK調(diào)控烯烴側(cè)鏈的產(chǎn)生，GS-OHP控制羥烷基側(cè)鏈的合成，GS-Null控制甲?；鶄?cè)鏈的形成（Kliebenstein，et al.，2001；Wittstock & Halkier，2002）。有人利用擬南芥 Columbia-Landsberg生態(tài)型和 Landsberg erecta-Cape Verde Island生態(tài)型的重組自交系，對緊密連接的GS-ALK和GS-OHP位點圖譜鑒定出 3個候選基因 AOP1、AOP2和 AOP3，它們都編碼依賴于 2-含氧戊二酸加氧酶。其中，AOP2起主要作用，能催化 3-甲基亞磺酰丙基和 4-甲基亞磺酰丁基硫苷轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烯烴基硫苷；AOP3能催化形成羥烷基硫苷；而AOP1被認(rèn)為是AOP2和AOP3起源的祖先基因，其功能還有待進(jìn)一步鑒定（Rosa et al.，1997；Kliebenstein，et al.，2001；Wittstock & Halkier，2002）。

此外，UGT74C1（UDP-glucosyl transferase 74C1，葡糖基轉(zhuǎn)移酶）、AtST5b和 AtST5c（Desulfoglucosinolate sulfotransferase，脫硫硫苷磺基轉(zhuǎn)移酶）等基因在脂肪族硫苷合成的二次修飾階段也起了一定的調(diào)控作用，UGT74B1、AtST5a等基因調(diào)控了酸式硝基化物（aci-Nitro compound）到脫硫硫苷（Desulfoglucosinolates）以及吲哚族硫苷的生物合成。在芳香族硫苷合成途徑中的PheAT（Phenylalanine aminotransferase，苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）基因，推測與合成同源苯丙氨酸有關(guān)，而AtST5a基因也可能在二次修飾中起調(diào)控作用，但UGT74C1、PheAT以及AtST5a等基因的功能還有待進(jìn)一步驗證（Gigolashvili et al.，2007b；Hirai et al.，2007）。

3 硫代葡萄糖苷合成的調(diào)控基因在十字花科植物育種上的應(yīng)用前景

近幾年來，隨著對硫苷一系列生物功能認(rèn)識的深入，硫苷又重新成為研究的熱點，比如硫苷及其降解產(chǎn)物能夠改變昆蟲的新陳代謝而導(dǎo)致昆蟲生長緩慢甚至死亡，抵抗廣食性昆蟲的為害。但是硫苷又能吸引寡食性昆蟲攝食或者產(chǎn)卵，這是因為寡食性昆蟲體內(nèi)有一種硫酸脂酶（Sulfatase），能夠減少異硫氰酸鹽的形成量，從而導(dǎo)致寡食性昆蟲對硫苷有了一定的適應(yīng)性。通過用小菜蛾對白菜進(jìn)行抗蟲性鑒定，發(fā)現(xiàn)高抗材料硫苷含量較少，感蟲材料含量普遍較高。但也有研究發(fā)現(xiàn)，硫苷含量在較低水平時，對寡食性昆蟲一般不具抗性；但當(dāng)含量超過一定濃度時，對寡食性昆蟲也會有抑制作用。目前在國際上有關(guān)十字花科植物硫苷合成調(diào)控基因的研究取得了很大進(jìn)展，例如從擬南芥中克隆出來的MYB28基因過表達(dá)的植物，體內(nèi)脂肪族硫苷的含量會升高，植物受昆蟲侵害的程度會減輕，因此可以將MYB28基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，以此來提高植物的抗蟲性。擬南芥MAM1突變體因4-甲基亞磺酰丁基硫苷含量低于野生型，非致病鐮刀菌對植株的易感性增強(qiáng)，由此利用改變硫苷某種組分的方式可以增強(qiáng)植物的抗病性。另外，增加脂肪族硫苷側(cè)鏈的長度，能夠減少甲蟲對植物的損傷，所以通過產(chǎn)生CYP79F1的無效突變體來改變硫苷的側(cè)鏈長度，增強(qiáng)十字花科植物的抗蟲能力。而AOP等位基因的多樣性表達(dá)也能影響硫苷的抗蟲性，可以通過基因工程來人為修飾硫苷的結(jié)構(gòu)達(dá)到目的。一旦在基因水平上能夠人為操縱硫苷的合成，那么也將有助于人類研制對抗癌癥的藥物。但目前存在的問題是硫苷的合成代謝要受到多個不同層次的影響，比如受少數(shù)遺傳位點、不同發(fā)育進(jìn)程、環(huán)境因子、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及代謝產(chǎn)物等多水平的調(diào)控，并且也與其他的許多代謝通路存在相互關(guān)系，所以要比先前預(yù)期的復(fù)雜得多。雖然目前對硫苷合成代謝的研究已取得了一定進(jìn)展，但仍然存在許多懸而未決的問題，還有許多調(diào)控硫苷合成的基因并不完全清楚。隨著科學(xué)研究的不斷深入，在未來的研究工作中可以利用遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因工程等手段來進(jìn)一步探索研究參與硫苷合成的相關(guān)調(diào)控基因，以期在基因水平上能夠人為操縱硫苷的生物合成，最終培育出抗病性好、抗蟲性廣和具有保健功能（如增加抗癌效應(yīng)）的十字花科作物新品種。

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