15N標(biāo)記S-芐基-L-半胱氨酸含量及其同位素豐度檢測

宋明鳴,杜曉寧

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

S-芐基-L-半胱氨酸(SBC)是巰基保護的氨基酸,是肽類藥物谷胱甘肽合成中重要的前體[1]。SBC可通過進一步酯化、Grignard反應(yīng)制得手性β-氨基醇,用作對潛手性酮進行不對稱還原反應(yīng)的手性配體[2]。15N是氮元素的穩(wěn)定同位素,作為示蹤劑廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。15N標(biāo)記氨基酸和多肽是研究醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的重要工具,在蛋白質(zhì)的人工合成、判定生物活性物質(zhì)(多肽、蛋白質(zhì))的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥用機理等領(lǐng)域都發(fā)揮著獨特的示蹤作用[3]。天然豐度半胱氨酸類化合物的分析檢測主要是采用高效液相色譜法(HPLC),其基本原理是利用該類化合物中的氨基與一系列衍生試劑反應(yīng),通過色譜柱分離后進行測定[4]。但該方法分析檢測時間過長,不利于對SBC樣品合成過程進行實時快速檢測。本研究擬對HPLC方法進行改進,建立一種新的簡便快捷的檢測方法。

1 主要儀器與試劑

2487型高效液相色譜儀:美國Waters公司產(chǎn)品,配備1525型兩元梯度泵,2487型紫外可見雙波長檢測器,Breeze色譜數(shù)據(jù)工作站;756MC紫外可見分光光度計:上海分析儀器二廠產(chǎn)品;MAT-271氣體同位素質(zhì)譜計:美國Finnigan質(zhì)譜公司;高溫電阻爐(又稱馬弗爐):上海實驗儀器廠;真空轉(zhuǎn)化系統(tǒng):系統(tǒng)真空度高于10-2Pa,本實驗室自制[5]。

SBC標(biāo)準(zhǔn)品:純度99%,ACROS公司產(chǎn)品;乙腈:色譜純,上海強順化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;N,N-二甲基甲酰胺:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;2,4-二硝基氟苯(DNFB)、碳酸氫鈉:分析純,中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;氧化銅、氧化鈣、5A分子篩、銅絲均為國產(chǎn)試劑。

2 實驗方法

2.1 SBC含量的測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制、衍生及含量測定

準(zhǔn)確稱取100 mg SBC標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,再加入5 mL 6 mol/L鹽酸溶液,用水稀釋至刻度,作為儲備標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。

移取1 mL配制好的儲備標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL容量瓶中,再加入2 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液和1 mL 1%DNFB乙腈溶液,在60℃水浴中避光反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用0.2 mol/L p H 7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。以4 000 r/min離心10 min,再用0.45μm濾膜過濾,得到標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液。用HPLC對標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液進行分析。分析條件:色譜柱為Cosmosil C18柱(5μm,150 mm×4.6 mm);流動相A為0.05 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=6.5,含10 mL/L N,N-二甲基甲酰胺);流動相B為V(乙腈)∶V(水)=3∶1。流動相B的梯度洗脫程序如下:0 min,75%;10 min,40%;13 min,5%;17 min,75%;流動相流速為1.0 mL/min;檢測波長為350 nm;柱溫為 30℃;進樣量為5μL。

2.1.2 樣品的衍生及含量測定

移取適量15N標(biāo)記SBC的發(fā)酵液至10 mL容量瓶中,再加入2 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液和1 mL 1%DNFB乙腈溶液,60℃水浴中避光反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。以4 000 r/min離心10 min,再用0.45μm濾膜過濾,得到待測樣品的衍生溶液。對樣品衍生溶液進行HPLC分析。分析條件與2.1.1節(jié)相同。

2.2 同位素15N豐度的測定

2.2.1 樣品處理

采用微量高溫燃燒法[6]轉(zhuǎn)化SBC樣品:稱取適量SBC標(biāo)準(zhǔn)品,與還原劑氧化銅、吸附劑氧化鈣、5A分子篩和銅絲一同加入樣品轉(zhuǎn)化管中[7],接入真空轉(zhuǎn)化系統(tǒng),在真空度高于0.05 Pa時將轉(zhuǎn)化管熔封,放入馬弗爐中,高溫下反應(yīng)數(shù)小時后取出,自然冷卻備用。

2.2.2 樣品的測定

用氣體同位素MAT-271質(zhì)譜計測定處理后的樣品中15N的豐度。

3 結(jié)果與討論

3.1 SBC含量的測定

3.1.1 分離條件的選擇

(1)檢測波長。對SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行波長全掃描,發(fā)現(xiàn)在檢測波長為200～400 nm區(qū)間內(nèi)有最大吸收。分別將波長設(shè)定為200、250、300、350、400 nm 對樣品溶液進行測定,從所得譜圖上看,λ=350 nm時,SBC峰強度最大,且其余雜質(zhì)峰相對較小,對計算結(jié)果的干擾最小,故選擇350 nm作為檢測波長。

(2)流動相 p H。分別配制 p H=6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0的流動相進行樣品溶液的測定,從譜圖上看,p H＜6.4時,SBC與其它雜質(zhì)峰會產(chǎn)生部分重疊,無法實現(xiàn)有效分離,且所有峰的保留時間都較大。pH＞6.4時,所有峰的拖尾現(xiàn)象都很嚴(yán)重,不利于組分的定量計算。通過實驗,流動相 pH為6.4時,分離效果最佳。pH=6.4時樣品的HPLC譜圖示于圖1。

圖1 SBC樣品HPLC譜圖(p H=6.4)

(3)柱溫。分別將柱溫設(shè)定為 20、25、30、35、40℃,對樣品溶液進行 HPLC分析。從HPLC譜圖上看,柱溫對于SBC峰強度的影響不大;但隨著溫度的升高,SBC與其他雜質(zhì)峰的分離度越來越小,不利于分析結(jié)果的計算。同時,柱溫越低,SBC及其他雜質(zhì)峰的保留時間越長,分析時間將大幅延長。綜合考慮,取柱溫為30℃。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

分別配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的SBC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按2.1.1節(jié)的方法進行HPLC分析,結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,在10 min以內(nèi)即可檢測到SBC的色譜峰,大幅節(jié)約了分析時間,有利于實現(xiàn)對反應(yīng)過程中SBC濃度的實時監(jiān)控。

以圖2中SBC峰的面積(y)對SBC溶液的濃度(x)作圖,得到SBC的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果示于圖3。對圖3進行線性回歸分析,其回歸方程為y=3×106x-4.16×104,R2=0.998 6。此結(jié)果表明,SBC的濃度c在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積A呈良好的線性關(guān)系。

圖2 SBC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

圖3 SBC標(biāo)準(zhǔn)曲線

檢出限的確定:取SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,采用逐級稀釋法,按進樣后所得譜圖中SBC峰信噪比約為3倍計算,得出該方法對于SBC溶液的檢測限為3.95×10-4g/L。

3.1.3 精密度實驗

取5μL SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行HPLC分析。重復(fù)進樣6次,所得HPLC譜圖中SBC峰面積列于表1。由表1可以看出,測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%。

表1 SBC精密度實驗結(jié)果

3.1.4 加標(biāo)回收實驗

在5批SBC含量為0.141 g/L的發(fā)酵液中分別加入等量的約1.0 g/L SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按前述方法衍生后進行HPLC分析。加標(biāo)后SBC理論含量為0.570 g/L,實測含量分別為0.556、0.555、0.553、0.555 、0.554 g/L 。據(jù)此計算得加標(biāo)回收率分別為 97.5%、97.4%、97.0%、97.4%、97.2%,平均回收率為97.3%。

3.1.5 樣品中SBC含量測定

按照本實驗方法對不同反應(yīng)時間得到的發(fā)酵液中SBC含量進行測定,結(jié)果示于圖4。從圖4可以看出,采用該發(fā)酵工藝合成SBC,反應(yīng)在很短的時間內(nèi)即可完成。隨著反應(yīng)時間的延長,SBC將繼續(xù)反應(yīng)生成其他產(chǎn)物,反而會降低其在發(fā)酵液中的含量。因此,采用該路線合成SBC時,建議反應(yīng)1 h后即可進行目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取。

對于該發(fā)酵工藝合成SBC中的其他影響因素(反應(yīng)溫度、投料配比等),采用本實驗方法也進行了進一步考察,均取得了滿意的結(jié)果。說明利用本研究建立的檢測方法,可為該發(fā)酵工藝合成SBC提供很好的指導(dǎo)作用。

圖4 反應(yīng)時間對SBC含量的影響

3.2 同位素15N豐度的測定

3.2.1 樣品的轉(zhuǎn)化處理條件

用高溫燃燒法[6,8]處理SBC樣品,針對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、樣品量等做了相關(guān)實驗,結(jié)果顯示,SBC樣品的轉(zhuǎn)化溫度為530℃,反應(yīng)時間為3 h,稱樣量2 mg可以滿足質(zhì)譜檢測要求。

3.2.2 樣品管中雜質(zhì)氣體的影響

SBC屬巰基保護的氨基酸,分子中所含的硫在高溫燃燒過程中會生成少量的SO2、H2S等雜質(zhì)氣體,這些雜質(zhì)氣體是否會對樣品轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響未見相關(guān)報道,本實驗利用普通SBC試劑對這一因素進行了考察,結(jié)果列于表2。由表2可以看出,樣品中硫的存在對樣品轉(zhuǎn)化和15N豐度測定的精確度不會產(chǎn)生影響。采用微量高溫燃燒法轉(zhuǎn)化SBC樣品可以滿足氣體同位素質(zhì)譜測定15N同位素豐度的要求。

表2 雜質(zhì)氣體對15 N豐度的影響

4 結(jié) 論

1)采用本工作建立的HPLC法測定發(fā)酵液中SBC的含量,操作簡便快捷,準(zhǔn)確度及精度高,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

2)采用本測定方法分析發(fā)酵液中SBC含量時,檢測波長、流動相的pH、柱溫等因素均對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。最佳分析條件為:檢測波長350 nm,流動相p H 6.4,柱溫 30℃。

3)采用微量高溫燃燒法進行樣品轉(zhuǎn)化,氣體同位素質(zhì)譜計分析15N標(biāo)記SBC中15N的同位素。該方法具有測定消耗樣品量少,精確度高的優(yōu)點,對于制備15N標(biāo)記SBC產(chǎn)品工藝優(yōu)化具有很好的指導(dǎo)作用。

[1] 孟獻梁,荀志金,賀忠,等.硫代芐基半胱氨酸結(jié)晶介穩(wěn)區(qū)的測定及分析[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,25(6):66-69.

[2] 陳維一,陸軍,蔣虹,等.含硫手性β-氨基醇的合成及其在對映選擇還原反應(yīng)中的應(yīng)用[J].有機化學(xué),2003,23(12):1 393-1 395.

[3] 柯昌武,羅勇,潘潔,等.酶法拆分氮-15標(biāo)記S-芐基-半胱氨酸的研究[J].上?；?2009,34(10):7-11.

[4] 蔡東聯(lián),陳小莉.高效液相測定同型半胱氨酸方法的建立[J].氨基酸和生物資源,2001,23(1):48-51.

[5] Smith CS,Chalk PM.Nitrogen gas preparative system for isotope-ratio analysis by mass spectrometry[J].Anal Chem Acta,1979,104:245-252.

[6] 杜曉寧,宋明鳴,趙誠.質(zhì)譜檢測用同位素15N標(biāo)記樣品的處理方法[J].原子能科學(xué)技術(shù),2009,43(增刊):59-63.

[7] 杜曉寧,李良君,李虎林,等.HG/T 3789—2005穩(wěn)定性同位素氖氣[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[8] 杜曉寧,宋明鳴,趙誠,等.13C-尿素同位素豐度的檢測方法[J].同位素,2010,23(1):39-43.