4-甲基咪唑雙膦酸的合成及其99Tcm標(biāo)記

翟好真,羅世能,王 燕,邱 玲,林建國(guó),夏詠梅

(1.江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所,衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214063)

有關(guān)研究[1-3]表明,雙膦酸鹽類藥物在預(yù)防惡性腫瘤骨并發(fā)癥和降低乳腺癌患者死亡率方面有重要作用。2003年,Reid[4]確定了雙膦酸鹽類藥物在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面的作用。雙膦酸鹽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了三代:第一代是以氯屈膦酸鹽為代表;第二代是以帕米膦酸二鈉為代表的含氮雙膦酸鹽,其抑制骨吸收的作用優(yōu)于第一代藥物;第三代包括具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的含氮雙膦酸鹽唑來(lái)膦酸和含氮不含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的伊班膦酸,作用強(qiáng)度和療效較第二代明顯提高,尤其是唑來(lái)膦酸鹽類,因其能特異性地作用于骨骼,對(duì)于癌癥骨轉(zhuǎn)移患者及惡性腫瘤引起的高鈣血癥患者有突出療效[5]。

近年來(lái),核醫(yī)學(xué)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,尤其是在醫(yī)學(xué)顯像方面,出現(xiàn)了一大類具有放射性骨顯像作用的藥物,相比傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)具有早診斷、早治療的優(yōu)點(diǎn)。99Tcm標(biāo)記亞甲基雙膦酸鹽是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的一類放射性骨顯像劑[6],但其在體內(nèi)清除較慢,給藥后需要3～4 h顯像。99Tcm標(biāo)記唑來(lái)膦酸鹽類是目前療效和顯像效果綜合應(yīng)用較好的一類藥物,國(guó)內(nèi)外有多項(xiàng)相關(guān)報(bào)道[7-12]。本研究擬以4-甲基咪唑?yàn)樵?合成 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(M4 IDP),并對(duì)其進(jìn)行99Tcm標(biāo)記,探討最佳標(biāo)記條件,測(cè)定標(biāo)記物體外穩(wěn)定性,為后期的生物學(xué)分布和顯像實(shí)驗(yàn)做基礎(chǔ)。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

Yanadimoto型熔點(diǎn)儀:日本YANACO公司;VARIO ELⅢ型元素分析儀:德國(guó)elementar公司;傅里葉變換紅外光譜儀:Bruker光譜儀器公司;WatersPlatform ZMD4000型質(zhì)譜儀:美國(guó)Waters公司;Bruker AM400型核磁共振儀:Bruker光譜儀器公司;PackardCobra型自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器:美國(guó) Victoreen公司;4-甲基咪唑:上海瀚鴻化工科技有限公司。99Tcm:740 GBq/L,江蘇省江原醫(yī)院。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(M4 IDP)的合成

M4IDP的合成路線示于圖1[7-10]。采用IR、MS及1H NMR對(duì)圖1中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.1.1 2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸乙酯(Ⅱ)的合成 在150 m L的三口燒瓶中加入8.2 g 4-甲基咪唑(Ⅰ)(0.1mol)、8.4 g KOH(0.15mol)、13.8 g K2CO3(0.1 mo l)、0.7 g四丁基溴化銨(2mmol)和75m LCH 2 Cl2,室溫?cái)嚢?.5 h后,將11.2m L溴乙酸乙酯(0.1mol)緩慢滴入,回流反應(yīng)8 h后過濾,濾餅用40 m L CH2Cl2洗滌2次,濾液用 150 m L飽和NaCl溶液洗滌,分層,有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥,之后蒸餾除去溶劑,得到10.6 g棕褐色粘稠液體,即2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸乙酯(Ⅱ)。

2.1.2 2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ)的合成在250m L三口燒瓶中加入8.4 g(0.05mol)

2.1.1節(jié)所得Ⅱ、100 m L蒸餾水和1 m L濃鹽酸,加熱回流反應(yīng)8 h后,加入2 g活性炭回流脫色0.5 h,之后熱過濾得淺褐色水溶液,蒸餾去除溶劑得淺褐色粘稠狀液體,向其中加入丙酮,攪拌后有固體析出,抽濾,干燥,之后用異丙醇重結(jié)晶得到白色固體6.1 g,即2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ)。

圖1 M4IDP的合成路線

2.1.3 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(Ⅳ)(M4IDP)的合成 在250 m L三口燒瓶中加入5.6 g(10.04 mol)2.1.2節(jié)所得Ⅲ,40m L氯苯和8m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的H 3 PO4,混勻,混合物加熱至100℃,攪拌反應(yīng) 0.5 h,之后將溫度降至65℃時(shí),緩慢滴加入10.4 m L三氯化磷(約 0.5 h滴加完畢),繼續(xù)升溫至100 ℃,反應(yīng) 3 h,冷卻,加入 50 m L 9 mol/L的鹽酸回流反應(yīng)6 h,冷卻,將反應(yīng)液倒入冷乙醇中,有固體析出,抽濾,干燥,用水重結(jié)晶,得白色固體3.4 g,即為目標(biāo)終產(chǎn)物M4IDP(Ⅳ)。

2.2 99Tcm-M4IDP的制備

取250 mg M4 IDP,用0.1 mol/L NaOH 溶液溶解,之后加水稀釋至5m L,配制成50 g/L的鈉鹽溶液,pH約6,備用。

將10 mg SnCl2·2H2O用10 m L 1 mol/L的鹽酸溶解,配制成1 g/L的SnCl2·2H2 O鹽酸溶液,備用。

在西林瓶中加入雙膦酸鈉鹽溶液和SnCl2·2H2O的鹽酸溶液,用0.2 mol/L pH 6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)調(diào)節(jié)混合液的pH,再向其中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,充分混勻,反應(yīng),即得99Tcm-M4IDP。

2.3 標(biāo)記率及放化純度的測(cè)定

用紙層析法測(cè)定99Tcm-M4 IDP的標(biāo)記率。取新華一號(hào)紙作為紙層析支持物,展開劑為V(丙酮)∶V(水)=2∶1,展開約 10 min后取出晾干,重復(fù)操作 3次,計(jì)算99Tcm-M4IDP、99TcmO2、99TcmO-4的 Rf分別為 0.2～0.4 、0、0.9～1.0,用γ計(jì)數(shù)器測(cè)各組分的放射性計(jì)數(shù),計(jì)算標(biāo)記率。

由于放化純度在某種程度上與標(biāo)記率相當(dāng),標(biāo)記物未經(jīng)進(jìn)一步純化[13]。

2.4 標(biāo)記條件的優(yōu)化

2.4.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響 取12個(gè)西林瓶,用移液器向每個(gè)瓶中加入0.1 m L M4 IDP鈉鹽溶液和0.1m L 1g/L的SnCl2·2H 2O溶液,用pH 6的PBS溶液調(diào)節(jié)體系pH約為6,向每個(gè)瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制為約2m L,每個(gè)反應(yīng)瓶分別在室溫下反應(yīng) 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。用紙層析法測(cè)標(biāo)記率。

2.4.2 pH對(duì)標(biāo)記率的影響 取5個(gè)西林瓶,用移液器向每個(gè)瓶中加入0.1 m L M4IDP鈉鹽溶液和0.1m L SnCl2·2H2O溶液,用pH 6的PBS溶液調(diào)節(jié)每個(gè)瓶中的pH 分別為 4、5、6、7和 8,再向每個(gè)瓶中分別加入 37 MBq的Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2 m L,室溫反應(yīng)30min。用紙層析法測(cè)標(biāo)記率。

2.4.3 SnCl2·2H 2O用量對(duì)標(biāo)記率的影響取10個(gè)西林瓶,用移液器向每個(gè)瓶中加入0.1m L M4 IDP鈉鹽溶液,再分別加入含0.005、0.01、0.03、0.05、0.08、0.10、0.12、0.15、0.20和0.25m g SnCl2·2H2O的水溶液,之后用pH 6的PBS溶液調(diào)節(jié)每個(gè)瓶中的pH約為6,再向每個(gè)西林瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2m L,室溫反應(yīng)30 min。用紙層析法測(cè)標(biāo)記率。

2.4.4 配體用量對(duì)標(biāo)記率的影響 取12個(gè)西林瓶,用移液器向每個(gè)瓶中分別加入含 1.0、1.5 、2.0 、2.5 、3.0 、3.5 、4.0 、4.5 、5.0 、6.0 、8.0和10.0mg M4IDP鈉鹽溶液,0.1 m L 1.0 g/L SnCl2·2H 2O溶液,用PBS溶液調(diào)每瓶中體系pH約為6,再向每個(gè)西林瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2 m L,室溫反應(yīng)30m in。用紙層析法測(cè)標(biāo)記率。

2.5 99Tcm-M 4 IDP的體外穩(wěn)定性測(cè)定

將最佳標(biāo)記條件下新制備的99Tcm-M4IDP置于室溫(25℃)下,分別于 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 、5.0、5.5、6.0 h 時(shí)取樣測(cè)定放化純度,考察99Tcm-M4 IDP在室溫下的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 M4IDP和主要中間體的表征

2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ):產(chǎn)率為54.8%,白色固體。mp:153～156℃;IR(KBr),σ/cm-1:3 328,1 644,1 603,1 450。ESI-MS(m/z):139(M)。1H NMR(500 MHz,DMSO):δ9.06(s,1H,CH ring),δ7.45(s,1H,CH ring),δ5.14(s,2H,CH 2 COOH), δ2.22(s,3H,CH3),[同分異構(gòu)體:δ9.00(s,1H,CH ring),δ7.42(s,1H,CH ring), δ5.10(s,2H,CH2COOH),δ2.22(s,3H,CH3)] 。 C6H8N2O2元素分析值(計(jì)算值):C:51.38%(51.42%),H:5.67%(5.75%),O:22.95%(22.83%),N:19.99%(19.99%)。

1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(Ⅳ):產(chǎn)率 29.7%;白色固體。m p:227～231 ℃;IR(KBr),σ/cm-1:3 398,3 200,2 930,2 875,1 665,1 620,1 448,1 245。ESI-MS(m/z):285(M-)。1H NMR(500 MHz,DMSO):δ7.54(s,1H,CH ring), δ6.86(s,1H,CH ring),δ4.30(s,2H,NCH2),δ2.01(s,3H,CH3),[同分異構(gòu)體:δ7.78(s,1H,CH ring),δ6.57(s,1H,CH ring), δ4.30(s,2H,CH2COOH),δ2.14(s,3H,CH3)]。C6H12N2O7P2元素分析值(計(jì)算值):C:25.19%(25.19%),H:4.18%(4.23%),O:39.11%(39.14%),N:9.83%(9.79%)。

當(dāng)咪唑環(huán)1N上有氫時(shí),氫原子可以在兩個(gè)氮原子間遷移,C-4和C-5是等同的,存在兩個(gè)互變異構(gòu)體,這兩個(gè)互變異構(gòu)體無(wú)法分離,化合物(Ⅲ)的1H NMR譜中顯示C-4與C-5的同分異構(gòu)體的比例為1∶1,化合物(Ⅳ)的1H NMR中顯示C-4與C-5的同分異構(gòu)體的比例為3∶1。

3.2 99Tcm-M4 IDP標(biāo)記條件的選擇

3.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖2。由圖2可知,反應(yīng)0～30min,標(biāo)記率與反應(yīng)時(shí)間基本呈正相關(guān),當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí),標(biāo)記率＞95%,30 min后,標(biāo)記率基本穩(wěn)定。因此,選定最佳反應(yīng)時(shí)間為30min。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響

3.2.2 pH對(duì)標(biāo)記率的影響 pH對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖3。由圖3可知,pH為4～6時(shí),標(biāo)記率隨著pH的增大而增大,pH為6時(shí),標(biāo)記率達(dá)到最大97.6%。繼續(xù)增大pH,標(biāo)記率則開始下降。因此,選取反應(yīng)體系pH為6時(shí)作為最佳標(biāo)記體系。

3.2.3 SnCl2·2H2O用量對(duì)標(biāo)記率的影響SnCl2·2H2O用量對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖4。

圖3 pH對(duì)標(biāo)記率的影響

由圖4可知,SnCl2·2H2O用量為30μg時(shí),標(biāo)記率＞93%,增加SnCl2·2H2O用量,標(biāo)記率成緩慢上升趨勢(shì),當(dāng)其用量為100μg時(shí),標(biāo)記率＞95%,此后再增大其用量,標(biāo)記率又略有減小。這是由于SnCl2·2H2O過多,容易生成膠體,致使標(biāo)記率降低。因此,選取SnCl2·2H2O最佳用量為100μg。

圖4 SnCl2·2H 2O用量對(duì)標(biāo)記率的影響

3.2.4 配體用量對(duì)標(biāo)記率的影響 M4IDP配體用量對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖5。由圖5可知,當(dāng)配體用量在5mg以下時(shí),標(biāo)記率與配體用量呈正相關(guān)趨勢(shì),用量為5 mg時(shí),標(biāo)記率已超過95%,繼續(xù)增加配體用量,標(biāo)記率趨于穩(wěn)定。因此,選定M4IDP的最佳用量為5mg。

3.3 最佳條件下的標(biāo)記

綜上所述,99Tcm-M4 IDP的最佳標(biāo)記條件為:反應(yīng)時(shí)間30 min,反應(yīng)體系 pH 6,SnCl2·2H2O用量為 100μg,M4IDP的標(biāo)記用量為5m g。選用最佳標(biāo)記條件得到99Tcm-M4IDP的標(biāo)記率＞95%。

3.4 99Tcm-M 4 IDP的體外穩(wěn)定性

圖5 配體用量對(duì)標(biāo)記率的影響

99Tcm-M4IDP在室溫下存放0.5～6 h,其放化純度的變化示于圖6。由圖6可知,放化純度在這段時(shí)間段里只有略微波動(dòng),平均放化純度＞95%,說(shuō)明其體外穩(wěn)定性較好,即可以在室溫下穩(wěn)定存放6 h。

圖 6 99Tcm-M4IDP的體外穩(wěn)定性

4 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)合成了M4IDP,并對(duì)其進(jìn)行了99Tcm標(biāo)記,優(yōu)化了99Tcm-M4IDP的標(biāo)記條件。合成路線和標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、易操作,且標(biāo)記率高,為后續(xù)研究99Tcm-M4IDP的臨床前藥理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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