中國(guó)北方漢族男性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因C936T單核苷酸多態(tài)性與HiHiLo后心功能變化的關(guān)聯(lián)研究

聶晶 胡揚(yáng) 衣龍燕 張漓

1江西師范大學(xué)（南昌 330022） 2北京體育大學(xué) 3國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所

低氧訓(xùn)練作為提高運(yùn)動(dòng)員有氧耐力素質(zhì)的手段已廣泛應(yīng)用，但訓(xùn)練效果存在明顯個(gè)體差異［1］，推測(cè)可能與機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性不同有關(guān)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性與低氧適應(yīng)能力有關(guān)［2，3］。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管內(nèi)皮特有的有絲分裂原，在生理性和病理性血管新生過(guò)程中均起關(guān)鍵的調(diào)控作用［4，5］。大量研究表明，低氧運(yùn)動(dòng)可使心肌組織中VEGF基因表達(dá)增加［6-8］，從而誘導(dǎo)心肌組織毛細(xì)血管的生成。這一過(guò)程將有利于增加心肌組織氧氣和能源物質(zhì)的供應(yīng)，增強(qiáng)心肌的工作能力。VEGF基因位于人類染色體6p21.3，是已發(fā)現(xiàn)的低氧反應(yīng)基因之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，在該基因的3’非翻譯區(qū)中，C936T單核苷酸多態(tài)性具有功能活性，與VEGF蛋白生成量的差異有關(guān)［9，10］。因此，鑒于VEGF基因在心肌中所發(fā)揮的重要生物學(xué)作用，能否利用C936T單核苷酸多態(tài)性預(yù)測(cè)低氧訓(xùn)練后心功能的變化，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)探討中國(guó)北方漢族男性VEGF基因C936T單核苷酸多態(tài)性與30天低氧訓(xùn)練前后心功能變化的關(guān)聯(lián)性，為制定個(gè)性化的低氧訓(xùn)練方案提供分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取62名中國(guó)北方漢族平原地區(qū)健康男性受試者，無(wú)低氧環(huán)境居住史，均來(lái)自北京體育大學(xué)體育系和運(yùn)動(dòng)系，平均年齡 21.10±1.37 歲，身高 177.82±5.40cm，體重68.46±8.15kg。受試者對(duì)實(shí)驗(yàn)均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低氧訓(xùn)練方案

HiHiLo方案：低氧睡眠+低氧訓(xùn)練+常氧專項(xiàng)訓(xùn)練，共 30天。其中，低氧睡眠 7d/周，每晚至少 10h（晚21∶00～次日晨 7∶00），氧濃度為 14.8%～14.3%（模擬海拔約 2800～3000m）；低氧訓(xùn)練 3次 /周，方式為常壓低氧環(huán)境（氧氣濃度為15.4%～14.8%，模擬海拔約2500～2800m）蹬功率自行車 30min（60r/min），以個(gè)體 75%VO2max強(qiáng)度為基礎(chǔ)，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中調(diào)節(jié)功率車負(fù)荷使受試者SpO2維持在87%～93%。其余時(shí)間在常氧環(huán)境下根據(jù)受試者的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目進(jìn)行專項(xiàng)訓(xùn)練。低氧環(huán)境由國(guó)產(chǎn)低氧發(fā)生設(shè)備提供。

1.2.2 左心室結(jié)構(gòu)和功能的測(cè)定

采用Doppler超聲心動(dòng)圖儀分別在HiHiLo前后測(cè)定1次。每次測(cè)試前受試者至少休息24h，測(cè)試圖像在仰臥、靜息5min后獲取。測(cè)試指標(biāo)包括直接測(cè)試指標(biāo)和衍生指標(biāo)。其中，直接測(cè)試指標(biāo)有左室舒張末內(nèi)徑（EDD）、左室收縮末內(nèi)徑（ESD）、左室舒張末后壁厚度（PWD）、舒張末室間隔厚度（IVSD）和心率（HR）；衍生指標(biāo)有每搏輸出量（SV）、每搏輸出量指數(shù)（SI）、心輸出量（CO）、心指數(shù)（CI）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室心肌重量（LVM）和左室心肌重量指數(shù)（LVMI）。

SV、EF 的測(cè)算參照改良 Simpson 法［11，12］。計(jì)算公式如下：CO（L·min-1）＝SV×HR；LVM（g）＝1.04×［（EDD+PWD+IVSD）3－EDD3］－14；體表面積（BSA）=0.006×身高（cm）+0.0128×體重（kg）－0.152；CI=CO/BSA；SI=SV/BSA；LVMI=LVM/BSA。

1.2.3 基因多態(tài)性分析

用Promega試劑盒提取全血DNA。采用PCR-RFLP進(jìn)行基因多態(tài)性分析。用primer premier5.0自行設(shè)計(jì)引物：上游引物：5’-ctc acc agg aaa gac tga tac ag-3’（23bp），下游引物：5’-ctc cca act caa gtc cac ag-3’（20bp）。PCR 擴(kuò)增體系 （15μl）：10×buffer 1.5μl，MgCl20.9μl，dNTP 0.3μl，primer 1.5μl，Taq 0.15μl，模板 0.5μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 40s，62℃退火50s，72℃延伸 50s，循環(huán) 35次；最后 72℃延伸 7min。酶切體系：7μl反應(yīng)體系：NlaⅢ2U，buffer 0.7μl，擴(kuò)增產(chǎn)物3.5μl，37℃酶切 4.5h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

變化率＝（訓(xùn)練后－訓(xùn)練前）∕訓(xùn)練前×100%。所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)包完成。采用卡方檢驗(yàn)和精確率檢驗(yàn)受試者基因型頻率是否符合H-W平衡定律；先用K-S檢驗(yàn)訓(xùn)練前后生理指標(biāo)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，低氧訓(xùn)練后的指標(biāo)變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同基因型之間訓(xùn)練前以及變化率差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平設(shè)為P<0.05，非常顯著性水平設(shè)為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 VEGF基因SNP/C936T基因型鑒定結(jié)果及分布特征

VEGF基因SNP/C936T分型結(jié)果見(jiàn)圖1。其中，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為457bp，經(jīng)NlaⅢ內(nèi)切酶酶切消化后，出現(xiàn)三種類型條帶：有酶切位點(diǎn)的純合型TT被切為265bp和192bp兩條帶；沒(méi)有酶切位點(diǎn)的純合型CC為457bp一條帶；雜合型CT為457bp、256bp和192bp三條帶。

62名受試者中CC型46人，頻率為74.19%；CT型15人，頻率為24.19%；TT型1人，頻率為1.61%。C等位基因頻率為86.29%，T等位基因頻率13.71%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：χ2（df=2）=0.00，P=1.00，表明該人群符合H-W平衡定律，具有群體代表性。

2.2 HiHiLo后受試者左心結(jié)構(gòu)功能的變化

表1顯示，30天低氧訓(xùn)練后，62名受試者左心結(jié)構(gòu)和功能均出現(xiàn)不同程度的變化。在結(jié)構(gòu)指標(biāo)中，EDD、ESD、PWD、IVSD、LVM、LVMI均較訓(xùn)練前有所增加，其中IVSD、PWD、LVM 和 LVMI增加十分顯著（P<0.01），變化率 分 別 為 2.47±5.30% 、2.98±7.95% 、4.04±6.26% 和4.38±6.40%。在功能指標(biāo)中，EF、SV、SI均較訓(xùn)練前顯著增加，其中，SV和 SI增加十分顯著（P<0.01）。而 HR、CO和CI均較訓(xùn)練前顯著下降，其中HR下降十分顯著（P<0.01），為 6.62±15.48%。

表1 受試者HiHiLo后左心結(jié)構(gòu)功能變化（n=62）

2.3 VEGF基因SNP/C936T與HiHiLo訓(xùn)練后左心結(jié)構(gòu)功能變化的關(guān)聯(lián)性

表2顯示，低氧訓(xùn)練前，CC基因型者和CT基因型者左心結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。30天低氧訓(xùn)練后，CC基因型者LVM、LVMI增加幅度顯著高于CT基因型（P<0.05），且SV、SI變化幅度也存在顯著性差異（P<0.01），即CC＞CT，其它指標(biāo)變化幅度在不同基因型之間未見(jiàn)顯著差異。

表2 不同基因型受試者HiHiLo后左心室結(jié)構(gòu)功能的變化

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，30天HiHiLo訓(xùn)練后，受試者左心形態(tài)功能均出現(xiàn)良好的生理性重塑。在形態(tài)方面，PWD、IVSD、LVM和LVMI增加幅度顯著。在心功能方面，EF、SV、SI均較訓(xùn)練前顯著增加，HR、CO和 CI均較訓(xùn)練前出現(xiàn)顯著性下降，其中SV、SI和HR變化幅度達(dá)到十分顯著水平（P<0.01）。以上結(jié)果表明，心臟出現(xiàn)了明顯的能量節(jié)省化，心力儲(chǔ)備顯著提高，并伴隨著以心壁增厚為主的運(yùn)動(dòng)性心臟肥大。這是機(jī)體對(duì)低氧刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性變化。但本結(jié)果與某些報(bào)道并不完全一致［13］。這可能與樣本量、運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目、訓(xùn)練水平、訓(xùn)練模式不同有關(guān)。

在低氧訓(xùn)練中，機(jī)體耐受缺氧的一個(gè)最明顯的適應(yīng)性變化就是誘導(dǎo)大量的新生血管形成。已有研究證實(shí)，低氧訓(xùn)練能夠促進(jìn)心肌毛細(xì)血管的生成［14，15］。心肌組織毛細(xì)血管增多，加大了心肌組織中氧氣從血液到細(xì)胞的彌散面積，加快了彌散速度，有利于心肌組織氧氣和能源物質(zhì)的交換，增強(qiáng)了心肌的工作能力，從而保證輸送更多的血液到運(yùn)動(dòng)器官。因此，低氧運(yùn)動(dòng)中心肌毛細(xì)血管的生理性重塑構(gòu)成了心肌有氧氧化和能量產(chǎn)生增多、心肌功能增強(qiáng)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而血管新生這一過(guò)程受到諸多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中VEGF最為重要。大量研究表明，缺氧、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)均可使心肌組織中VEGF基因表達(dá)上調(diào)［6-8，16-18］。還有研究推測(cè)VEGF基因參與了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大的形成機(jī)制［8］。因而，VEGF基因在心功能改善中發(fā)揮了重要的作用。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因序列的改變會(huì)影響VEGF蛋白的生成量、活性，以及基因表達(dá)［9，10，19，20］。這可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致低氧訓(xùn)練后心功能改善效果上的個(gè)體差異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，HiHiLo訓(xùn)練后，CC基因型者心臟表現(xiàn)出更好的生理性重塑。其中，CC基因型者LVM、LVMI、SV和SI的增加幅度均顯著高于CT基因型者，而其它指標(biāo)變化幅度在不同基因型之間未見(jiàn)顯著差異。以上結(jié)果表明，VEGF基因C936T多態(tài)性與低氧訓(xùn)練后部分心形態(tài)功能指標(biāo)（LVM、LVMI、SV、SI）的變化有關(guān)聯(lián)。而且提示了CC基因型者對(duì)于HiHiLo訓(xùn)練表現(xiàn)出更好的心臟適應(yīng)能力，主要反映在心肌收縮力以及心臟泵血功能方面。運(yùn)動(dòng)員心臟增大（室壁增厚和心腔擴(kuò)大）對(duì)增強(qiáng)心臟做功以及提高每搏量極其重要。而每搏量提高體現(xiàn)了心肌收縮力以及心臟泵血功能的增強(qiáng)。因此，推測(cè)CC基因型者在HiHiLo后心肌組織中VEGF基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)了心肌毛細(xì)血管的增生，改善了心肌的氧供、增加了能量的生成、從而增強(qiáng)心肌收縮射血的能力。其關(guān)聯(lián)原因可能與該多態(tài)所處的位置有關(guān)。有研究顯示，VEGF基因的3’非翻譯區(qū)參與了低氧誘導(dǎo)人VEGF mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)［21］。堿基由 C→T可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP-4結(jié)合位點(diǎn)的消失，改變了mRNA穩(wěn)定性，從而影響VEGF mRNA水平。在低氧條件下，mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)是導(dǎo)致穩(wěn)定的VEGF mRNA增加的原因［22］。Renner等研究證明，C936T多態(tài)性與較低的血漿VEGF水平關(guān)聯(lián)，攜帶T等位基因者血漿VEGF水平偏低［9］。但該多態(tài)也可能只是與某個(gè)功能性的多態(tài)位點(diǎn)處于連鎖不平衡。因此，本研究所選取的C936T多態(tài)究竟是不是影響心功能（SV、SI）變化的功能位點(diǎn)，這需要進(jìn)一步對(duì)該基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序和功能研究。而且，本研究中T等位基因頻率分布較低，TT基因型者只有1人，因而還有待加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 總結(jié)

VEGF基因C936T多態(tài)性與HiHiLo訓(xùn)練后的LVM、LVMI、SV及SI的變化有關(guān)聯(lián)。其中，CC基因型LVM、LVMI、SV以及SI增加幅度均顯著高于CT基因型，提示CC基因型者在HiHiLo后產(chǎn)生了更好的心臟適應(yīng)性變化，可作為預(yù)測(cè)HiHiLo后部分心功能（SV、SI）變化的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

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