復方新會陳皮含片質(zhì)量控制研究

昌水平　梁志云　張明　張俊杰　余香　陳觀鳳　張軍

【摘要】目的：建立復方新會陳皮含片的質(zhì)量控制方法。方法：采用TLC鑒別含片中新會陳皮、蛇膽汁、甘草；采用高效液相色譜法同時測定含片中甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil C18 柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為 5 μm）；以乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫；檢測波長為237 nm、254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃。結果：復方新會陳皮含片色譜中，與新會陳皮的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素及甘草的甘草苷、甘草酸銨對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，陰性對照試驗無干擾。各對照品峰面積與進樣質(zhì)量呈良好的線性關系，其回歸方程分別為橙皮苷：y=267.92x+10.046，r=0.9992；川陳皮素：y=2771.4x-15.586，r=1；橘皮素：y=1692.3x+4.7767，r=0.9999；甘草苷：y=1684.6x+8.3101，r=0.9991；甘草酸銨：y=347.97x+12.726，r=0.9993。平均加樣回收率分別為94.93%（RSD=0.76%），101.10%（RSD=1.39%），102.36%（RSD=0.91%），101.75%（RSD=1.98%），102.33%（RSD=1.60%）。結論：復方新會陳皮含片質(zhì)量控制實驗研究建立了藥材的TLC定性鑒別方法和含片中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甘草苷、甘草酸銨的含量測定方法，能有效地控制復方新會陳皮含片制劑的質(zhì)量。

【關鍵詞】復方新會陳皮含片；質(zhì)量控制；實驗研究

【中圖分類號】R282【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）12-0024-06

Experimental Study on QualityControl of Compound Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium Buccal TabletsCHANG Shuiping LIANG Zhiyun ZHANG Ming ZHANG Junjie YU Xiang CHEN Guanfeng ZHANG Jun

1.Jiangmen Xin Hui Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangmen 529100，China；

2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，ChinaAbstract：Objective To establish the quality control method for compound Xinhui citri reticulatae pericarpium buccal tablets. Methods TLC was used to identifycitri reticulatae pericarpium， snake bile and licorice.The contents of liquiritin， ammonium glycyrrhetate， hesperidin，nobiletin and tangeretin in lozenges were determined by high performance liquid chromatography.Octadecylsilane bonded silica gel was used as filler （Kromasil C18 column length 250 mm， inner diameter 4.6 mm， particle size 5 μm）.Acetonitrile （A） -0.05% phosphoric acid solution （B） was used as mobile phase in gradient elution. The detection wavelength was 237 nm and 254 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃.Results In the chromatogram of compound Xinhui citri reticulatae pericarpium buccal tablets，there were chromatographic peaks with the same retention time corresponding to the chromatographic positions of hesperidin，nobiletin，tangeretin，liquiritin and ammonium glycyrrhetate， and the negative control test had no interference.There was a good linear relationship between the peak area of each reference substance and the injection quality， and the regression equations were as follows：hesperidin：y=267.92x+10.046，r=0.9992. nobiletin：y=2771.4x-15.586，r=1. Tangeretin：y=1692.3x+4.7767，r=0.9999. liquiritin：y=1684.6x+8.3101，r=0.9991.ammonium glycyrrhetate：y=347.97x+12.726， r=0.9993.The average recovery rates respectively were 94.93%（RSD=0.76%），101.10%（RSD=1.39%），102.36%（RSD=0.91%），101.75%（RSD=1.98%），102.33%（RSD=1.60%）.Conclusion The TLC method for qualitative identification and determination of hesperidin，nobiletin，tangeretin，liquiritin and ammonium glycyrrhetate in lozenges were established，which can effectively control the quality of compound Xinhui citri reticulatae pericarpium buccal tablets.

Keywords：Compound Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium Buccal Tablets；QualityControl；ExperimentalStudy

復方新會陳皮含片是將江門市新會區(qū)中醫(yī)院由新會陳皮、蛇膽、甘草、桔梗炮制的特色飲片研制成口含片劑型，該含片制劑作過一些研究［1-2］。按照“醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法”（試行）要求，在原處方用量、用法，沒有使原組方中治療疾病的物質(zhì)基礎改變的前提下，采用新會陳皮碎成細粉；甘草與桔梗煎煮，濃縮，加入蛇膽汁混勻，噴霧干燥成藥粉；藥粉與新會陳皮細粉混勻，制成含片。為了有效地控制其內(nèi)在質(zhì)量，本文參照《中國藥典》和《廣東省中藥材標準》的有關指標［3-4］，對含片中新會陳皮、蛇膽汁、甘草的TLC鑒別，含片中甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量測定開展了實驗研究，取得結果良好，現(xiàn)報道如下。

1實驗儀器與試藥

PTy-C5200電子天平，華志電子科技有限公司；AB204-N電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；SQP電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；101-1AB電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TC-15套式恒溫器，海寧市新華醫(yī)療器械廠；N-1100V旋轉蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；2500y高速多功能粉碎機，武義海納電器有限公司；80目、100目國家標準檢驗篩，浙江天臺飛達金屬篩網(wǎng)廠。

橙皮苷對照品（批號：MUST-20031701），川陳皮素對照品（批號：MUST-20041210），橘皮素對照品（批號：MUST-20072310），甘草苷對照品（批號：MUST-20052110），均由成都曼斯特生物科技有限公司提供。甘草酸銨（批號：111610-201005，中國食品藥品檢定研究院）。新會陳皮飲片（批號：20200201，廣東龍晟制藥有限公司），甘草飲片（批號：20200703，江西宏康中藥飲片有限公司），桔梗飲片（批號：202005101，樟樹市慶仁中藥飲片有限公司），蛇膽汁（批號：201101，廣州康圣藥業(yè)有限公司），復方新會陳皮含片（批號：20211208，20220224，江門市新會區(qū)中醫(yī)院）。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2方法與結果

2.1鑒別

2.1.1新會陳皮的鑒別取本品2片，研細，稱取約1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備廣陳皮陰性樣品溶液。另取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》（2020年版）（四部）通則0502）進行試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠Ｇ薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（100∶17∶13）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。如圖1所示。

2.1.2甘草的薄層色譜鑒別取本品12片，研細，稱取約6 g，加70%乙醇50 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液加濃鹽酸3 mL，搖勻，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘渣分次加水20 mL，在研棒攪拌下使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，用水洗滌3次，每次30 mL，棄去水液，乙醚液加氨水振搖提取2次，每次20 mL，合并氨水液，加濃鹽酸使pH為1～2，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，水洗3次，每次20 mL，棄去水液，乙醚液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性樣品溶液。另取甘草對照藥材粉末1 g，加乙醇20 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液加濃鹽酸2 mL，搖勻，自“加熱回流1 h”起，同法制成制成對照藥材溶液4 mL。參照薄層色譜法（《中國藥典》（2020年版）（四部）通則0502）試驗，吸取上述溶液各3 μL，分別點于同一硅膠Ｇ薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至各樣品斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm） 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。如圖2所示。

2.1.3蛇膽汁的薄層色譜鑒別取供試品15片，研細，稱取粉末10 g，用水飽和正丁醇30 mL超聲提取30 min，濾過，濾液用正丁醇飽和水洗滌３次，每次15 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性樣品溶液。另取蛇膽汁對照藥材，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為蛇膽汁對照藥材溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》（2020年版）（四部）通則0502）試驗，吸取上述蛇膽汁對照藥材溶液5 μL、供試品溶液及陰性樣品溶液各15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（10∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖3所示。

2.2色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil C18 柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為 5 μm）；以乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為237 nm、254? nm，梯度洗脫方法見表1。

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液的制備取復方新會陳皮含片研磨成粉末，精密稱取粉末約0.7 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.3.2陳皮陰性對照溶液的制備取缺少陳皮藥材的陰性對照樣品，同供試品“2.3.1供試品溶液的制備”項下操作，制備陰性對照溶液。

2.3.3甘草陰性對照溶液的制備取缺少甘草藥材的陰性對照樣品，同供試品“2.3.1供試品溶液的制備”項下操作，制備陰性對照溶液。

2.3.4對照品溶液的制備

2.3.4.1甘草苷對照品儲備液的制備取甘草苷對照品約10.5 mg，精密稱定（10.44 mg），置50 mL量瓶中，以70%乙醇溶解，加70%乙醇至刻度，搖勻，備用。

2.3.4.2甘草酸銨對照品儲備液的制備取甘草酸銨對照品約12.5 mg，精密稱定（10.53 mg），置25 mL量瓶中，以70%乙醇溶解，加70%乙醇至刻度，搖勻，備用。

2.3.4.3橙皮苷對照品儲備液的制備取橙皮苷對照品約30.5 mg，精密稱定（30.68 mg），置100 mL量瓶中，以甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.3.4.4川陳皮素對照品儲備液的制備取川陳皮素對照品約7.5 mg，精密稱定（7.56 mg），置25 mL量瓶中，以甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，備用。再精密移取2.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為配制混標備用液。

2.3.4.5橘皮素對照品儲備液的制備取橘皮素對照品約7.8 mg，精密稱定（7.84 mg），置25 mL量瓶中，以甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，備用。再精密移取2.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為配制混標備用液。

2.3.4.6混合對照品溶液的制備精密移取甘草苷對照品儲備液1.4 mL、甘草酸銨對照品儲備液1.6 mL、橙皮苷對照品儲備液2.8mL、川陳皮素對照品儲備液2.1 mL、橘皮素對照品儲備液1.7 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。（甘草苷0.05846 mg/mL，甘草酸銨0.07610 mg/mL，橙皮苷0.08494 mg/mL，川陳皮素0.01576 mg/mL，橘皮素0.01321 mg/mL）。

2.4專屬性試驗及結果分別精密吸取全方供試品溶液和陰性樣品溶液各14 μL、混合對照品溶液16 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。如圖4、圖5所示。

結果可見，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，且陰性對照試驗無干擾。

2.5標準曲線的繪制精密吸取“2.3.4.6”項下混合對照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、12 μL，按“2.2”項下色譜條件，甘草苷、甘草酸銨在237 nm波長處依次進樣測定，并以進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程甘草苷為y=1684.6x+8.3101，r=0.9991，濃度在0.02832～0.3398 μg范圍內(nèi)；甘草酸銨為：y=347.97x+12.726，r=0.9993，表明在0.1947～2.3368 μg范圍內(nèi)；橙皮苷、川陳皮素、橘皮素在254 nm波長處依次進樣測定，橙皮苷回歸方程為y=267.92x+10.046，r=0.9992，濃度在0.2521～3.0251 μg范圍內(nèi)；川陳皮素為y=2771.4x-15.586，r=1，濃度在0.1123～1.3477 μg范圍內(nèi)，橘皮素為y=1692.3x+4.7767，r=0.9999，濃度在0.06515～0.7818 μg范圍內(nèi)，進樣質(zhì)量與峰面積均呈良好的線性關系。

2.6精密度試驗精密吸取上述“2.3.4.6”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的峰面積RSD值分別為0.43%、0.64%、2.83%、1.85%、0.77%。表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗取本品細粉約0.35 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法自“密塞”起，制備供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按“2.2”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD值分別為甘草苷0.98%、甘草酸銨1.80%、橙皮苷2.25%、川陳皮素1.51%、橘皮素1.47%，表明在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復性試驗按“2.3.1”供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品，按“2.2”色譜條件測定。試驗結果表明，復方新會陳皮含片中甘草苷含量為2.0483 mg·g-1，RSD值為0.86%；甘草酸含量為4.9996 mg·g-1，RSD值為0.71%；橙皮苷含量為5.9545 mg·g-1，RSD值為2.04%；川陳皮素含量為1.0222 mg·g-1，RSD值為1.52%；橘皮素含量為0.9083 mg·g-1，RSD值為1.98%。表明本方法重復性良好。

2.9加樣回收試驗精密稱取已知含量的樣品0.35 g，各6份，置具塞錐形瓶中，精密加入“2.3.4”項下甘草苷對照品溶液3.4 mL，甘草酸銨對照品溶液3.8 mL，橙皮苷對照品溶液8.3 mL，川陳皮素對照品溶液1.1 mL，橘皮素對照品溶液0.9 mL，再精密加入80%甲醇32.5 mL，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法自“密塞”起，制備加標供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。結果見表2。

試驗結果顯示，甘草苷平均加樣回收率為101.75%，RSD為1.98%；甘草酸平均加樣回收率為102.33%，RSD為1.60%；橙皮苷平均加樣回收率為94.93%，RSD為0.76%；川陳皮素平均加樣回收率為101.10%，RSD為1.39%；橘皮素平均加樣回收率為102.36%，RSD為0.91%。表明本方法回收率良好。

2.10樣品含量測定取兩批復方新會陳皮含片樣品，按“2.3.1”項下制備方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，外標法計算樣品中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甘草苷、甘草酸的含量，結果見表3。

3討論

有研究［5-6］表明新會陳皮中含有多種黃酮類活性成分，橙皮苷具有抗炎抗過敏性哮喘的作用，還具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效。橘皮素可以減少炎癥細胞浸潤起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用等［7］。川陳皮素可顯著抑制5種腫瘤細胞的生長，且對HeLa細胞的抑制效果最好，可促進HeLa細胞的凋亡，并可以增加其凋亡蛋白酶caspase的活性［8］；川陳皮素對支氣管有舒張作用能起到平喘的治療效果［9］。甘草酸是一個最重要的甘草甜素類化合物，有顯著的腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可用于人體抗衰老、抗炎、降壓、增強機體免疫力、提高生理機能、抑制癌細胞生長等，甘草酸在臨床上的應用表明了其確實的療效［10］。甘草苷可以升高氧化酶活性，減少炎性因子的產(chǎn)生，進一步減輕UVB對細胞造成的氧化損傷，抑制皮膚光老化。甘草營對UVB誘導HaCaT細胞光老化的保護作用［11］。本實驗建立了復方新會陳皮含片中主要藥材新會陳皮、蛇膽汁、甘草的薄層色譜鑒別方法，耐用性考察試驗結果表明，所建立的方法對特征斑點分離度好、陰性無干擾，且方法耐高濕、低濕、低溫，可用于復方廣陳皮含片的薄層定性鑒別。含量測定項，建立了含片中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甘草苷、甘草酸同時測定的HPLC含量測定方法，對方法進行專屬性、線性、精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收考察。結果顯示，平均加樣回收率分別為94.93%（RSD=0.76%），101.10%（RSD=1.39%），102.36%（RSD=0.91%），101.75%（RSD=1.98%），102.33%（RSD=1.60%），所建立方法簡便、快速，結果準確可靠，適用于復方新會陳皮含片制劑的質(zhì)量控制。參考文獻

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（收稿日期：2022-10-12編輯：劉斌）