星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化5-氟尿嘧啶殼聚糖微囊的制備工藝

張海峰 ,王 瑋,白 穎,楊 浩 ,趙 輝

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,河南 開封 475004)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化5-氟尿嘧啶殼聚糖微囊的制備工藝

張海峰 ,王 瑋＊,白 穎,楊 浩 ,趙 輝

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,河南 開封 475004)

目的:應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化5-氟尿嘧啶殼聚糖微囊的制備工藝,以提高微囊性質(zhì)的可預(yù)測(cè)性。方法:以殼聚糖為囊材,采用單凝聚法將5-氟尿嘧啶微囊化,以載藥量、包封率、粒徑、跨距為因變量對(duì)殼聚糖濃度、芯壁比、乳化劑用量和成囊溫度4個(gè)自變量的各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合,并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果:通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)法得出微囊的最佳制備工藝條件為:殼聚糖濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%,芯壁比1.5,乳化劑的用量8%,成囊溫度50℃。結(jié)論:星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化微囊制備工藝預(yù)測(cè)性良好,制得的微囊具有囊型好、粒徑分布均勻、重現(xiàn)性好、包封率高且制備工藝穩(wěn)定的特點(diǎn)。

殼聚糖;氟尿嘧啶;微囊;單凝聚法;星點(diǎn)設(shè)計(jì)法

殼聚糖(Chitosan,CS)來源廣泛,性質(zhì)穩(wěn)定,生物相容性和降解性好,毒性極小,應(yīng)用范圍廣泛,在藥劑學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用極為活躍。它在緩釋制劑中作為微囊、微球的囊材或載體,也可以作為緩釋片、緩釋膜的骨架材料[1]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-fu)是一種時(shí)間效應(yīng)性抗代謝、抗腫瘤藥物,已廣泛用于消化道癌癥及其他實(shí)體瘤的治療[2]。但5-fu血漿半衰期極短,需頻繁給藥,且毒副作用較大,不易被患者所接受,有必要制備結(jié)腸定位給藥制劑。為了確立最佳的制備工藝,本文用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法對(duì)成囊工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design,CCD),安排試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便,試驗(yàn)次數(shù)較少,且在中心點(diǎn)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn),可以提高數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[3]。其特點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)距中心點(diǎn)的距離相等,自變量的極端水平為實(shí)驗(yàn)所允許的極大、極小值,一次設(shè)計(jì)即可獲得較佳條件,與以往常用的正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)相比,具有精度高、預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與儀器

1.1 材料

殼聚糖(濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司,脫乙酰度90.5%);5-fu(武漢合中生化制造有限公司,批號(hào)20080506);戊二醛(天津博迪化工有限公司);硫酸鈉(淄川雙豐化工廠,批號(hào) 20070520);吐溫(天津市紅巖化學(xué)試劑廠,批號(hào) 20060824);冰醋酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào) 20060808);氫氧化鈉(天津石英鐘廠霸州市化工分廠)等。

1.2 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);XS-2000型生物顯微鏡(濟(jì)南勝利科學(xué)器材有限公司);JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(日本電子);754型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);YP-600型電子天平(上海第二天平儀器廠)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 5-fu標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 5-fu紫外測(cè)試波長(zhǎng)的選擇 將5-fu、殼聚糖用0.1mol/L鹽酸分別配制成20mg/L的溶液,在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),進(jìn)行紫外吸收波長(zhǎng)掃描,確定5-fu在266nm處有最大吸收,而殼聚糖在266nm處幾乎沒有吸收。故確定5-fu標(biāo)準(zhǔn)曲線在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)266nm處測(cè)定。

2.1.2 5-fu的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取105℃下干燥至恒重的5-fu 50.0mg,置于100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,溶解搖勻,即得0.5 g/L的5-fu貯備液。精密量取5-fu貯備液5.0mL于25mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 于 10mL 容量瓶中 ,以甲醇定容,在波長(zhǎng)266nm處測(cè)定吸收度 A值。以吸收度 A值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A=0.0506C+0.0480,相關(guān)系數(shù) r=0.9995,5-fu在濃度2～14mg/L有較好的線性關(guān)系。

2.2 單凝聚法制備微囊

分別稱取一定質(zhì)量的殼聚糖,充分溶解于體積分?jǐn)?shù)為2.0%的稀醋酸溶液中,制得不同濃度的殼聚糖稀酸溶液。量取處方量的5-fu溶液(200 g/L)和吐溫加入其中,隨后開始水浴加熱并攪拌使其乳化。待乳化完成后,調(diào)節(jié)體系p H至4～5,加入沉淀劑使之凝聚,用一定體積的蒸餾水稀釋上述母液,再調(diào)節(jié)體系的p H至8.5左右,最后加入戊二醛進(jìn)行固化。放置60min沉降、抽濾、洗滌、干燥,收取微囊。

2.3 微囊制備工藝的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)微囊性質(zhì)影響較顯著的4個(gè)因素作為考察對(duì)象,即殼聚糖濃度、芯壁比、乳化劑的用量和成囊溫度。根據(jù)CCD的原理[4-5],每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平,各因素的極大和極小水平根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和制備的實(shí)際需要而定。因素及水平見表1,實(shí)驗(yàn)安排見表2。

以載藥量、包封率、平均粒徑為因變量,分別對(duì)各因素(自變量)各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。多元線性回歸:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4,二項(xiàng)式擬合:Y = b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b5X12+b6X22+b7X32+b8X42+b9X1X2+b10X1X3+b11X1X4+b12X2X3+b13X2X4+b14X3X4。刪除擬合優(yōu)度不佳(lack of fit)即 P<0.05的各相關(guān)系數(shù),再進(jìn)行擬合,求得簡(jiǎn)化方程,以該數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ),描繪三維因變量面(response surface),由因變量面選取較佳工藝條件,按較佳工藝制備微囊,并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素及水平表

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表及各項(xiàng)值

3 結(jié)果

3.1 微囊形狀及粒徑分布

在顯微鏡下觀察大部分微囊為球形單囊,且囊形圓整、分散較好、不粘連。用校正過的帶目鏡測(cè)微尺的顯微鏡測(cè)微囊的囊徑大小與分布,計(jì)數(shù)3批,每批300個(gè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在殼聚糖濃度較大的條件下制得的微囊粒徑相對(duì)較大,在殼聚糖濃度較小的條件下制得的微囊粒徑相對(duì)較小。

3.2 載藥量及包封率的測(cè)定

將制得的(不同條件)殼聚糖-5-fu微囊置于研缽中研細(xì),精密稱取微囊適量Wm(g),用0.1mol/L的鹽酸溶液溶解,經(jīng)超聲粉碎,抽濾得提取液,定容至50mL。以0.1mol/L鹽酸溶液為空白,在266nm處測(cè)定其吸光度值 A,根據(jù)5-fu標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算其濃度C(mg/L),再計(jì)算載藥量和包封率(見表2)。

式中:Wc為被包裹入微囊的5-fu的量;Wm為殼聚糖微囊及所包裹5-fu的總重量;W0為加入的5-fu藥物總量。

3.3 最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

由圖1所示星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件是殼聚糖濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、芯壁比為1.5、乳化劑用量為8%、成囊溫度50℃,并由此最佳制備工藝制備的微囊符合要求。此條件下制得的微囊外觀見圖2。

圖1 響應(yīng)優(yōu)化器尋優(yōu)結(jié)果

圖2 最佳條件下制得的微囊外觀圖

3.3.1 載藥量和包封率 按照3.2中的測(cè)定方法,測(cè)定以最佳制備工藝條件下制備的CS-5-fu微囊的載藥量和包封率。3批CS-5-fu微囊的測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 載藥量和包封率結(jié)果

3.3.2 微囊形狀及粒徑分布 按最佳制備工藝條件下制備5-fu微囊,并在光學(xué)顯微鏡下觀察。大部分微囊為球形單囊,且囊形圓整、分散較好、不粘連。用校正過的帶目鏡測(cè)微尺的顯微鏡測(cè)微囊的囊徑大小與分布,計(jì)數(shù)3批,每批300個(gè)。微囊的平均粒徑為(12.66±3.26)μm,跨距為0.78,粒徑分布見圖3。

圖3 CS-5-fu微囊的粒徑分布圖

3.3.3 粒徑、包封率與載藥量的關(guān)系 由圖4可以看出,當(dāng)減小粒徑時(shí),跨距增大,載藥量和包封率減少;當(dāng)提高載藥量時(shí),粒徑可能變大。針對(duì)這些因素,只有對(duì)載藥量、包封率等指標(biāo)綜合考慮,其優(yōu)化的條件才是最佳選擇。

圖4 粒徑、包封率與載藥量的3D散點(diǎn)關(guān)系圖

4 討論

CS濃度在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～0.5%左右時(shí)候,能形成均勻的圓形微囊,且粒徑隨著濃度的升高而增大。隨著CS濃度升的更高時(shí),CS醋酸溶液的黏度將會(huì)增加,不易成囊。

反應(yīng)溫度為50℃時(shí)該反應(yīng)體系所成的微囊包封率理想,微囊粒徑均一度高。溫度太高時(shí),由于溶劑蒸發(fā),形成局部濃度過濃,囊材相互凝聚而不能成囊,在顯微鏡下可見CS成絮狀凝出。如溫度太低,由于囊材相互之間不能很好融熔,因此成囊也不理想。當(dāng)凝聚成囊后,必須使其在較低的溫度下膠凝。

從電解質(zhì)對(duì)膠凝的影響看,陰離子起主要作用,其電荷數(shù)愈高膠凝作用愈強(qiáng)。常見的陰離子中,SO42-促進(jìn)膠凝的作用最強(qiáng),Cl-次之,而SCN-則可阻止膠凝。據(jù)此,本研究所選用的凝聚劑是Na2SO4,所需加入的量與所使用的CS的分子量有關(guān),隨著分子量的增加而增加。

在制備工藝和處方篩選中,可采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件模擬模型對(duì)最佳工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。本文所選取的指標(biāo)均為量化指標(biāo),以提高優(yōu)化預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。本文選定了4個(gè)主要指標(biāo):載藥量、包封率、粒徑和跨距,其中載藥量、包封率越大越好,提高載藥量可以相應(yīng)減少給藥微囊的量;粒徑越小,混懸及注射時(shí)均較方便,且還能實(shí)現(xiàn)靶向部位給藥;跨距越小,微囊粒徑分布均勻,有利于控制質(zhì)量,保證平穩(wěn)的釋放曲線。

[1]王小紅,馬建標(biāo),何炳林.甲殼素、殼聚糖及其衍生物的應(yīng)用[J].功能高分子學(xué)報(bào),1999,12(2):199-202.

[2]王海艷,季宇彬.5-氟尿嘧啶現(xiàn)代給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥,2007,28(10):452-455.

[3]吳偉,崔光華.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學(xué)中的應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè),2000,27(5):292-298.

[4]Takayama K,Nagai T.Novel computer optimization methodology for pharmaceutical formulations investigated by using sustained-release granules of indomethacin[J].Chem Pharm Bull,1989,37(1):160-167.

[5]Do B,Robinet S,Pradeau D,et al.Application of central composite designs for optimization of the chromatographic separation of monomerthylarsonate and dimethylarsinate and of selenomethionine and selenite by ion-pair chromatography coupled with plasma mass spectrometric detection[J].Analyst,2001,12(6):594.

[責(zé)任編輯 姬 荷]

Optimization of the preparation for chitosan 5 fu microcapsules by central composite design

ZHANG Hai-feng,WANG Wei＊,BAI Ying,YANG Hao,ZHAO Hui(Pharmaceutical College ofHenan University,Kaifeng,Henan475004,China)

Objective:To use central composite design to optimize the preparation of chitosan-5-fu microcapsules,and to enhance predicting the properties microcapsules.Methods:Microcapsules were prepared by monophasic coagulation method with chitosan as capsule material.The effects of four independent variables were evaluated on a number of response variables.The response variables selected in this study were the drug loading,the loading efficiency and the mean diameter.The second order polynomial and linear equations were fitted to the data,and the resulting equations were predicted and analyzed.Results:The best technique to prepare the microcapsules is the concentration of CS=0.15%,the proportion of core to wall 1.5,emulsifier dosage 8%,T=50℃.Conclusion:The central composite design to optimize the preparation of chitosan microcapsules containing 5-fu has the good predicting properties,the shape of capsule prepared is good,well-repeated,well-sealed and stable,and the particles are evenly distributed.

chitosan;5-fu;microcapsules;monophasic coagulation;central composite design

O636

A

1672-7606(2010)04-0249-04

2010-08-10

河南大學(xué)校內(nèi)基金項(xiàng)目(04YBRW060)

張海峰(1983-),男,河南信陽人,碩士研究生,從事藥物緩控釋與微粒靶向制劑的研究工作。

＊通訊作者:王瑋(1964-),男,河南 開封 人,博士,碩士生導(dǎo)師,教授,從事藥物緩控釋與微粒靶向制劑的研究工作。