革蘭陽性菌青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展*

朱竟赫,郭文潔,劉耀川,趙敬翠,龐 杰,劉明春

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)是細(xì)菌胞漿膜上的一種微小蛋白質(zhì),分子質(zhì)量在30 ku～150 ku之間。PBPs由Suginaka等于1972年第一次報道,當(dāng)時發(fā)現(xiàn)它能和青霉素共價結(jié)合而得名。后來研究發(fā)現(xiàn)PBPs也能與非β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合[1]。本文綜述了革蘭陽性菌PBPs研究進(jìn)展。

1 概述

多數(shù)細(xì)菌都有細(xì)胞壁,用以維持細(xì)胞形態(tài)以及抵抗內(nèi)部膨脹壓力。革蘭陽性菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖,它是聚糖絲由肽類交聯(lián)而成的網(wǎng)狀高分子物質(zhì)。聚合過程中存在3種關(guān)鍵的酶類,即糖基轉(zhuǎn)移酶、肽基轉(zhuǎn)移酶和D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(D,D-羧肽酶)。糖基轉(zhuǎn)移酶可延長雙糖肽的多糖鏈;肽基轉(zhuǎn)移酶的可是使雙糖肽相互交聯(lián)聚合成網(wǎng)狀的肽聚糖;D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的可在轉(zhuǎn)肽作用過程中由羧肽酶催化將D-丙氨酰-D-丙氨酸間的肽鏈斷裂,釋放出一個D-丙氨酰殘基。肽聚糖合成過程中的某些反應(yīng)就是由PBPs家族的某些成員催化完成的[2]。

β-內(nèi)酰胺類抗生素能專一性地與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的PBPs結(jié)合,干擾PBPs的正常酶功能(如干擾細(xì)胞壁肽聚糖合成),使細(xì)胞壁合成阻斷。不同的β-內(nèi)酰胺類抗生素與不同的PBPs結(jié)合,可引起細(xì)菌自溶、形成球形體或形成絲狀細(xì)胞,最終細(xì)菌停止分裂而死亡。PBPs是參與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、形態(tài)維持和糖肽結(jié)構(gòu)調(diào)整等作用的一組酶。PBPs介導(dǎo)的細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性可能與PBPs的改變有關(guān):①PBPs含量必需發(fā)生變化或缺失;②與抗生素的親和力降低;③細(xì)菌產(chǎn)生緩慢結(jié)合的PBPs;④誘導(dǎo)性 PBPs的出現(xiàn),即不依賴β-內(nèi)酰胺酶的存在而對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。這種由PBPs介導(dǎo)的耐藥性在革蘭陽性菌比革蘭陰性菌中更常見,如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus,MRSA)、耐青霉素肺炎球菌(penicillin resistant strep tococcus pneumoniae,PRSP)等[3]。

另外,在革蘭陰性菌中有外膜存在,且具有非常有效的通透屏障作用,能阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)膜靶位,減少抗生素的吸收;而大多數(shù)革蘭陽性菌具有一層很厚的肽聚糖細(xì)胞壁,無細(xì)胞外膜,機(jī)械性強(qiáng),但因其篩子結(jié)構(gòu)粗糙,很難阻止小分子物質(zhì),如抗生素的擴(kuò)散。所以多數(shù)革蘭陽性菌不存在膜通透性下降的耐藥機(jī)制[4]。

2 PBPs分類

2.1 按氨基酸序列的相似程度分類

按氨基酸序列的相似程度可將PBPs分為A型高分子質(zhì)量PBPs、B型高分子質(zhì)量PBPs和低分子質(zhì)量PBPs三類。A型高分子質(zhì)量PBPs是一類雙重功能的PBPs,它的N末端具有糖基轉(zhuǎn)移酶的作用,C末端具有肽基轉(zhuǎn)移酶的作用。B型高分子質(zhì)量PBPs只有肽基轉(zhuǎn)移酶的活性,在某些情況下,具有維護(hù)細(xì)胞形態(tài)的作用。低分子質(zhì)量PBPs普遍具有D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(D,D-羧肽酶)的活性,可催化D-丙氨酰-D-丙氨酸間的肽鏈斷裂,釋放出一個D-丙氨酰殘基,在肽聚糖交聯(lián)過程中起重要作用[5]。

2.2 根據(jù)細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性分類

根據(jù)細(xì)菌對各種β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性不同,可將PBPs大致分為兩類:①對青霉素的敏感性稍差,但對大多數(shù)頭孢菌素敏感的PBPs。其分子質(zhì)量較低(24.8 ku～34.7 ku),一般為D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶,如金黃色葡萄球菌的PBP4。②對青霉素和頭孢菌素均敏感的 PBPs。其分子質(zhì)量較高(59.5 ku～89.3 ku),羧基末端是青霉素結(jié)合域,催化青霉素敏感的肽聚糖轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng),氨基末端催化青霉素不敏感的肽聚糖轉(zhuǎn)糖基酶反應(yīng)。

已知不同的抗生素作用于不同的PBPs上,即使是同一抗生素對于不同細(xì)菌也是作用于不同的PBPs上。如頭孢噻肟作用于鏈球菌的靶位是PBP2x,而作用于金黃色葡萄球菌的靶位是PBP2;苯唑西林也主要作用于金黃色葡萄球菌的PBP2,而金黃色葡萄球菌的PBP3卻是頭孢拉定的主要作用點。作用于同一PBPs靶位的抗生素合用會產(chǎn)生相互拮抗作用,作用于不同PBPs的β-內(nèi)酰胺類抗生素在聯(lián)用時可產(chǎn)生協(xié)同作用[6]。

2.3 根據(jù)與細(xì)菌生理功能的關(guān)系分類

根據(jù)與細(xì)菌生理功能的關(guān)系大致可以將PBPs分為細(xì)菌生長必需蛋白和非必需蛋白。仍以耐藥金黃色葡萄球菌為例,PBP1、PBP2、PBP3、PBP4為其固有的蛋白質(zhì),而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(M RSA)中的PBP2a為耐藥菌所特有的,不是菌體必須的蛋白質(zhì),但有了它細(xì)菌可對青霉素產(chǎn)生耐藥性。

3 革蘭陽性菌的PBPs及相關(guān)機(jī)制

不同細(xì)菌的PBPs組成不同,其功能和耐藥機(jī)制也有一定的差別。研究表明,并非所有的PBPs都是抗生素的作用靶位?，F(xiàn)在研究得比較多的是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌等。

3.1 肺炎鏈球菌

有研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌共有6種PBPs,它們分別是 PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b 和 PBP3。其分子質(zhì)量分別為 100、100、89.4、82、78 和43 ku 。敏感肺炎鏈球菌的PBP-1a/1b、PBP-2a/2x/2b都很容易被β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合而達(dá)到殺菌目的[7]。肺炎鏈球菌耐藥株4個分子質(zhì)量較大的PBP1a、PBP2x、PBP2a和PBP2b與青霉素的親和力明顯降低。這4個PBPs是β-內(nèi)酰胺類抗生素作用的致命靶點[8]。肺炎鏈球菌對青霉素耐藥是多基因逐步變異累加的結(jié)果,其中 PBP1a、PBP2x和 PBP2b起主要作用,PBP2x和PBP2b為原耐藥抗性決定簇,它們的變異可導(dǎo)致低水平耐藥。當(dāng)PBP1a發(fā)生變異時通常導(dǎo)致高水平耐藥,但與此同時 PBP2x和PBP2b中至少應(yīng)該有一種發(fā)生變異[9]。最近研究顯示由鑲嵌基因?qū)е碌牡陀H和力PBP2x和PBP1a是產(chǎn)生高水平頭孢噻肟耐藥的主要原因[10]。

3.2 格登鏈球菌

格登鏈球菌具有3種A型高分子質(zhì)量青霉素結(jié)合蛋白,分別是 PBP1a、PBP1b、PBP2a和 2種 B型青霉素結(jié)合蛋白,分別是PBP2b和PBP2x。它們對于青霉素耐藥是很重要的。在格氏鏈球菌高耐藥菌株中,發(fā)生變異的基因是pbp2b和pbp2x。盡管耐藥株中 pbp1a、pbp1b、pbp2a不發(fā)生變異,但它們在耐藥過程中仍然起著重要的作用。滅活PBP1a和PBP2a中的任何一個,該菌株都不能產(chǎn)生耐藥性,且 pbp2b和pbp2x也不能發(fā)生變異[11]。

3.3 金黃色葡萄球菌

PBP2a是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的主要青霉素結(jié)合蛋白。據(jù)目前研究,甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌存在 5種PBPs,即PBP1(84.3 ku)、PBP2(80.4 ku)、PBP3(74.4 ku)、PBP4(44.6 ku)以及PBP2b。PBP2b是由pbpF基因編碼的,含有691個氨基酸,分子質(zhì)量為 77.4 ku。近年研究表明PBP1在肽聚糖交聯(lián)過程中不起主要作用,它的功能必須整合到細(xì)胞分裂機(jī)制過程中才能發(fā)揮作用[12]。另外,在甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌中還有PBP2a,此蛋白由macA基因編碼。m acA是MRSA的主要耐藥基因。m ecA僅存在于MRSA和極少數(shù)耐甲氧西林的表皮葡萄球菌中,其編碼產(chǎn)物PBP2a可替代菌體原有的由pbp2基因編碼的PBP2蛋白。PBP2a與青霉素的結(jié)合能力較差,可維持菌體肽聚糖的穩(wěn)定,從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[13]。此外,金黃色葡萄球菌中的PBP1是一種肽酰轉(zhuǎn)移酶,在金葡菌細(xì)胞周期中PBP1起雙重作用,它既是細(xì)胞分隔中的必需蛋白又是一種在細(xì)胞分裂末期產(chǎn)生關(guān)鍵信號的肽酰轉(zhuǎn)移酶[14]。

3.4 腸球菌

腸球菌對青霉素的耐藥機(jī)制主要有3種:①β-內(nèi)酰胺酶機(jī)制。②產(chǎn)生過剩的PBP4或PBP5機(jī)制;③PBP4或PBP5青霉素結(jié)構(gòu)域變異導(dǎo)致的青霉素親和力降低機(jī)制[15]。在腸球菌屬中,PBPs的C端是β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合靶位,由3個氨基酸保守盒STFK、K TG和SDN構(gòu)成,基因突變均發(fā)生在其鄰近區(qū)域,使腸球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力降低[16]。其中,引起糞腸球菌耐藥的低親和力PBPs為PBP4[15],屎腸球菌為PBP5[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對非典型糞腸球菌藥法羅培南的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生低親和力PBP4[15]。PBP5為B類PBPs,經(jīng)鑒定屎腸球菌中存在兩種A類 PBPs即PbpF和PonA與PBP5相配合,肽聚糖絲可由A類PBPs獨立合成,當(dāng)PbpF和PonA缺失是可導(dǎo)致肽聚糖交聯(lián)減少[17]。

3.5 枯草芽孢桿菌

在枯草芽孢桿菌中主要有16個PBPs,按序列相似性劃分它們包括4個A型高分子質(zhì)量PBPs,6個B型高分子質(zhì)量PBPs和6個低分子質(zhì)量PBPs。它們在肽聚糖合成、細(xì)胞形態(tài)、芽孢形成和芽孢萌發(fā)方面有著各種作用。4種A型PBPs分別是PBP1、PBP2c、PBP4 和 PBP2d。其中 PBP1、PBP2c和PBP4缺失,尤其是PBP1的缺失,將引起繁殖體生長率下降和芽孢生長量減少[18]。有研究表明Ywhe(第4號A型PBPs編碼基因)在繁殖體的肽聚糖合成中無作用,并且其編碼的蛋白Ywhe只在前芽孢中存在。PBP2c在繁殖體和芽孢中均有發(fā)現(xiàn)。PBP2c可能和Ywhe一起與芽孢肽聚糖合成及芽孢萌發(fā)有關(guān)[19]。B型PBPs在維持細(xì)胞形態(tài)方面有特殊的作用,它的序列使它具有與大腸埃希菌PBP3(由ftsI編碼)相似的功能。枯草芽孢桿菌的PBP2a(由pbpA編碼)在芽孢生長時從橢圓形孢子形成桿狀細(xì)胞的過程中起重要作用。它與大腸埃希菌的PBP2類似,也是維持細(xì)菌桿狀形態(tài)的?？莶菅挎邨U菌PBP3,由 pbpC編碼,從細(xì)菌生長、芽孢形成、芽孢萌發(fā)幾個方面來看并不是十分重要。spoVD的產(chǎn)物是B型PBP,在芽孢肽聚糖合成方面有重要作用。另外兩個B型PBP ykuA和yrrR的作用尚未確定。低分子質(zhì)量PBPs為D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶,轉(zhuǎn)肽時有催化D-丙氨酰-D-丙氨酸間的肽鏈斷裂的作用[20]。

細(xì)胞分裂蛋白 EzrA和一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白GpsB在枯草芽孢桿菌延伸-分配循環(huán)中起關(guān)鍵作用。這些基因的突變導(dǎo)致細(xì)菌在細(xì)胞分裂和細(xì)胞延長中的綜合表型缺陷。它們還導(dǎo)致細(xì)胞極點成熟作用失敗。EzrA主要促進(jìn)PBP1向特定部位聚集,而GpsB則主要促進(jìn)PBP1在完成極點成熟作用后與細(xì)胞極點分離[21]。

3.6 棒狀桿菌

在棒狀桿菌中通常有8個高度保守的PBPs,以谷氨酸棒狀桿菌為例,其中有4種高分子質(zhì)量PBPs(HMW-PBPS),分別為 PBP1a、PBP1b、PBP2a 和PBP2b;兩種低分子質(zhì)量青霉素結(jié)合蛋白(LMWPBPS),分別為PBP4和PBP4b;還有兩種可能存在的結(jié)合性β-內(nèi)酰胺酶,它們也具有結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素的能力,分別稱為PBP5和PBP6。Valbuena N等[22]用基因敲除的方法研究得出,在4種HMWPBPS中PBP1b和PBP2b最為重要,只有當(dāng)PBP1b和PBP2b同時缺失時對于細(xì)菌才是致命的,細(xì)菌無法生長。

3.7 分支桿菌

分支桿菌中主要存在4種PBPs,按分子質(zhì)量大小排列分別為 PBP1、PBP2a、PBP2b和 PBP3,它們的表觀分子質(zhì)量分別為 102、90、87、50 ku。在多數(shù)情況下分支桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素有固有的耐藥性。其原因有PBPs對β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力降低、產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的通透性降低。分支桿菌的耐藥性為這3種機(jī)制的綜合表現(xiàn)[23]。研究顯示,結(jié)核分支桿菌中存在一種PBPA,它使B型高分子質(zhì)量PBPs,可以結(jié)合氨芐青霉素,在細(xì)胞分裂和維持細(xì)胞形態(tài)方面有重要作用,在絲氨酸-蘇氨酸激酶PknA和PknB調(diào)節(jié)下參與細(xì)胞中隔的肽聚糖合成[24]。

總之,青霉素結(jié)合蛋白在革蘭陽性菌細(xì)胞壁合成過程中起著至關(guān)重要的作用,其種類很多,編碼基因不同,分子質(zhì)量大小也有不小的差異,但其作為肽聚糖合成中的關(guān)鍵酶類的功能相近。在發(fā)生β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥時,PBPs相應(yīng)的基因發(fā)生變異,構(gòu)成了細(xì)菌耐藥機(jī)制中的重要部分。因此進(jìn)一步深入研究革蘭陽性菌的PBPs及其相關(guān)耐藥機(jī)制,將對臨床用藥及新藥開發(fā)提供重要參考。

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