山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子水平的影響*

帥學(xué)宏,蘇子杰,胡庭俊*,曾 蕓,韋英益,李躍華

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

山豆根又名廣豆根,小黃連,為豆科植物柔枝槐(Sophora subprostrata)的根,主產(chǎn)廣西,性寒,味苦,具有清火解毒,消腫止痛等功效[1]。山豆根多糖(Sophora subprostrata polysaccharide,SSP)是從其根部提取出來(lái)的一種天然多糖。它不僅可刺激淋巴細(xì)胞增殖,促進(jìn)PWM誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生,刺激小鼠淋巴細(xì)胞分泌IgG[2],且具有抗氧化作用[3]。山豆根多糖還可以增加小鼠脾臟 T淋巴細(xì)胞分泌NO和IL-2,升高Ca2+濃度和增強(qiáng) PKC活性[4]。研究表明,淋巴細(xì)胞表面存在多糖受體,多糖通過(guò)與受體結(jié)合,可啟動(dòng)淋巴細(xì)胞信息傳遞,進(jìn)而影響淋巴細(xì)胞基因表達(dá)和活化增殖[5]。本試驗(yàn)觀察了山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)、6-酮-前列腺素 F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)和一氧化氮(NO)信號(hào)分子的影響,為進(jìn)一步揭示山豆根多糖的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 良風(fēng)花雞,雄性,健康,60日齡。

1.1.2 藥物與試劑 山豆根多糖,為灰白色粉末、易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑,由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫藥理實(shí)驗(yàn)室分離提取。臨用時(shí)滅菌后用完全1640配成溶液;6-keto-PGF1α和 TXB2試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所;cAMP和cGMP試劑盒購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室;無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸為天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;二鹽酸-1-萘乙二胺為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);梅特勒-托利多AB104-L電子天平(瑞士);GC-2016型γ放射免疫計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及分組 將供試雞經(jīng)頸靜脈放血處死,無(wú)菌條件下采其脾臟,用D-Hank's洗去表面血液。在培養(yǎng)皿中加入適量的D-Hank's液,將脾臟在其中剪成小塊,輕輕磨碎后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾,收集濾液,緩慢加在等體積的雞淋巴細(xì)胞分離液中,2 000 r/min離心10 min,收集中間層的淋巴細(xì)胞,用D-Hank's液洗滌兩次后加入無(wú)酚紅的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,調(diào)整濃度為4×106cells/mL。取4個(gè)24孔培養(yǎng)板,分為4個(gè)時(shí)間段即 4、8、12、24 h,每個(gè)時(shí)間段分為5組,即空白對(duì)照組、4種濃度的山豆根多糖組。每組4個(gè)孔,每孔加1 mL淋巴細(xì)胞懸液,然后加入多糖使終濃度達(dá)到 50、100、200、400 μ g/mL。將培養(yǎng)板置入41℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、8、12、24 h,分時(shí)段離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清,上清用于測(cè)定NO、6-keto-PGF1α和TXB2濃度。細(xì)胞經(jīng)裂解后用于測(cè)定 cAMP和cGMP濃度。

1.2.2 測(cè)定方法 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用放射免疫法測(cè)定 cAMP、cGMP、6-keto-PGF1α和 TXB2。參照龐戰(zhàn)軍Griess試劑法[6]略有改進(jìn),測(cè)培養(yǎng)液中NO 含量 ,以 NaNO2為標(biāo)準(zhǔn) ,取 0、5、10、25、50、100、160、200、250 μ mol/L 幾個(gè)濃度按表 1作標(biāo)準(zhǔn)曲線,單位mL(表1)。

表1 NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1 The preparation of NO2-standard curve

吸取樣品液1 mL,加入等體積Griess試劑,室溫反應(yīng)10 min,550 nm比色測(cè)OD值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 cAMP測(cè)定結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,山豆根多糖在24 h內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生cAMP有顯著的影響,100 μ g/mL SSP在4 h時(shí)能顯著升高 cAMP的濃度(P＜0.05),8 h時(shí)cAMP含量達(dá)到最高值,與對(duì)照組比差異極顯著(P＜0.01),之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),cAMP的含量逐漸減少。其他濃度的SSP對(duì)cAMP的含量也有不同程度的影響,總體呈先上升后下降的趨勢(shì)(表2)。

表2 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞中cAMP的影響Table 2 Effect of SSP on cAMP in chicken splenic lymphocyte pmol/10 mL

2.2 cGMP測(cè)定結(jié)果

從表3結(jié)果可以看出,不同濃度的山豆根多糖作用于體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞,除了4 h時(shí)間段400 μ g/mL的 SSP對(duì) cGMP有所降低外 (P ＜0.05),其他組SSP對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 cGMP無(wú)顯著的影響。

2.3 山豆根多糖對(duì)cAMP/cGMP的影響

山豆根多糖對(duì)cAMP/cGMP影響比較明顯,SSP 以 100 μ g/mL 或 400 μ g/mL 濃度與淋巴細(xì)胞培養(yǎng)4 h和8 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP/cGMP比值極顯著升高(P ＜0.01),以后呈下降趨勢(shì),24 h時(shí)雖然50 μ g/mL多糖組的比值低于對(duì)照組,但其他組基本到達(dá)正常值,各濃度多糖組對(duì)cAMP/cGMP比值隨時(shí)間延長(zhǎng)總體呈先升高后降低的趨勢(shì)(表4)。

2.4 6-keto-PGF1α測(cè)定結(jié)果

培養(yǎng)4 h時(shí)100 μ g/mL的SSP可明顯升高6-keto-PGF1α濃度 (P ＜0.05),至 8 h 時(shí) 100、200、400 μ g/mL山豆根多糖均能顯著升高 6-keto-PGF1α的濃度(P ＜0.05),到12 h時(shí)除400 μ g/mL的SSP組6-keto-PGF1α濃度有所升高外,其他濃度組都開(kāi)始下降,24 h時(shí)各組均接近正常值(表5)。

表3 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞中cGMP的影響Table 3 Effect of SSP on cGMP in chicken splenic lymphocyte pmol/10 mL

表4 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞中cAMP/cGMP比值的影響Table 4 Effect of SSP on cAMP/cGM P in chicken splenic lymphocy te

表5 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌6-keto-PGF1α的影響T able 5 Effect of SSP on 6-keto-PGF1αsecretion of chicken splenic lymphocytes pg/mL

2.5 TXB2測(cè)定結(jié)果

山豆根多糖對(duì)培養(yǎng)液中TXB2濃度有升高作用,SSP濃度為100 μ g/mL,在 4 h時(shí)能顯著升高 TXB2濃度(P＜0.05),8 h時(shí)極顯著升高 TXB2濃度(P＜0.01),從12 h開(kāi)始下降,到24 h與對(duì)照組無(wú)顯著差異(表6)。

表6 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌TXB2的影響T able 6 Effect of SSP on T XB2secretion of chicken splenic ly mphocytes pg/mL

2.6 山豆根多糖對(duì)6-keto-PGF1α/TXB2的影響

4種濃度的山豆根多糖均可升高6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P ＜0.05)。與對(duì)照組比較,培養(yǎng)8 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL 、400 μ g/mL 能分別顯著、極顯著升高 6-keto-PGF1α/TXB2的比值 (P ＜0.05、P＜0.01)。與對(duì)照組比較,培養(yǎng)12 h時(shí),4種濃度的山豆根多糖均可顯著升高 6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P ＜0.05)(表7)。

表7 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞6-keto-PGF1α/TXB2影響Table 7 Effect of SSP on PGF1α/TXB2in chicken splenic lymphocytes

2.7 NO測(cè)定結(jié)果

一氧化氮濃度=(測(cè)定管 OD550-0.073)/0.004 6。相關(guān)系數(shù)r=0.995,NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,4種濃度的山豆根多糖對(duì)NO的濃度均有升高作用。與對(duì)照組比較,培養(yǎng)4 h,山豆根多糖濃度為 200 μ g/mL,能顯著升高 NO的濃度(P ＜0.05);培養(yǎng) 8 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL、100 μ g/mL,分別能顯著升高 NO的濃度 (P ＜0.05);培養(yǎng) 12 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL、400 μ g/mL,分別能極顯著升高NO的濃度(P ＜0.05);培養(yǎng) 24 h,山豆根多糖濃度為 100 μ g/mL、200 μ g/mL,分別能顯著升高 NO的濃度(P ＜0.05)(表8)。

圖1 NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 NO2-standard curve

表8 山豆根多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的影響Table 8 Effect of SSP on NO production in chicken splenic lymphocytes

3 討論

細(xì)胞內(nèi)主要有以 cAMP、cGMP、DG、IP3和Ca2+為第二信使的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,各個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)彼此聯(lián)系構(gòu)成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[7]。在真核細(xì)胞中,cAMP和cGMP是重要的第2信使物質(zhì),分別由腺苷酸環(huán)化酶和鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶合成[8]。當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶活化時(shí),細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生cAMP信號(hào),通過(guò)蛋白激酶使蛋白質(zhì)磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)。cGMP與cAMP一樣廣泛存在于動(dòng)物和微生物中,具有細(xì)胞內(nèi)第2信使的功能。cGMP產(chǎn)生信號(hào)傳遞機(jī)制與cAMP相似[9]。現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,cAMP與 cGMP相互頡頏,密切配合,共同完成生理調(diào)節(jié)功能。一般認(rèn)為 cAMP能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化,而cGMP可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂,cAMP與cGMP比值在一定程度上反映機(jī)體免疫功能、細(xì)胞增殖和能量代謝等方面的狀態(tài),當(dāng)該比值增大時(shí),表明機(jī)體免疫功能增強(qiáng),反之則表示機(jī)體免疫功能下降[10]。有研究表明[11],雞接種IBD弱毒疫苗提高機(jī)體免疫力時(shí),可以提高細(xì)胞內(nèi)和血漿中信息分子環(huán)核苷酸水平,抗IBDV引起cAMP水平和cAMP/cGMP比值低下。石放雄等[12]研究一種從植物中提取制成的純天然多糖復(fù)合體產(chǎn)品時(shí)發(fā)現(xiàn)其能顯著升高雞血漿和肝臟中cAMP、cGMP以及其比值。本試驗(yàn)表明山豆根多糖能明顯升高雞脾臟細(xì)胞中cAMP的水平以及cAMP/cGMP的值,提示山豆根多糖能夠通過(guò)cAMP/cGMP途徑增強(qiáng)機(jī)體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

做為一種新發(fā)現(xiàn)的第2信使,花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物越來(lái)越受到人們的關(guān)注?；ㄉ南┧崞浯x產(chǎn)物前列腺素、血栓素等的活性不僅可在細(xì)胞外作為第一信使產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng),還在細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞中有重要意義。花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物具有促進(jìn)或放大一些胞內(nèi)信使系統(tǒng)的作用[13]?；ㄉ南┧岽x產(chǎn)物TXA2和PGI2是血栓素類(lèi)和前列腺類(lèi)物質(zhì)較為重要的成分,發(fā)揮著主要的生理功能,但TXA2和PGI2在動(dòng)物體內(nèi)性質(zhì)不穩(wěn)定,易生成性質(zhì)穩(wěn)定的6-keto-PGF1α和 TXB2。因而,多通過(guò)測(cè)定 6-keto-PGF1α和 TXB2的變化來(lái)反映 TXA2和 PGI2的變化情況。6-keto-PGF1α-TXB2是一對(duì)平衡體系,6-keto-PGF1α/TXB2比值是衡量該體系是否處于穩(wěn)態(tài)的標(biāo)志之一。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),山豆根多糖能升高雞脾臟淋巴細(xì)胞6-keto-PGF1α和 TXB2水平,當(dāng)培養(yǎng) 12 h時(shí)6-keto-PGF1α/TXB2比值升高顯著,說(shuō)明該多糖能促進(jìn)和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞內(nèi)磷脂、甘油三酯及膽固醇的水解作用并對(duì)所釋放的花生四烯酸代謝具有重要調(diào)節(jié)作用,從而調(diào)控免疫細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸信號(hào)分子的水平及相關(guān)基因的表達(dá)。這與胡庭俊等[14]研究蕨麻多糖的結(jié)果基本一致。

NO由細(xì)胞內(nèi)NO合成酶催化精氨酸經(jīng)氧化脫氨生成,具有廣泛生物活性。NO在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[15]。據(jù)報(bào)道蘆薈多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO生成[16],黃芪多糖也能促進(jìn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO[17]。有研究認(rèn)為NO可活化鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP起到第2信使的作用[18]。胡庭俊等報(bào)道黃芪多糖是通過(guò)NO介導(dǎo)信號(hào)傳遞通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度,升高脾淋巴細(xì)胞蛋白激酶活性而影響機(jī)體免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的[19]。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)山豆根多糖能促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞NO的生成。由于NO與免疫應(yīng)答及炎癥有關(guān),在免疫系統(tǒng)中作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要介質(zhì)而起作用,故NO可能與cGMP構(gòu)成一條信號(hào)傳導(dǎo)通路,本結(jié)果提示山豆根多糖可能通過(guò)影響NO-cGMP信號(hào)通路而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

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