小鼠空腸肥大細(xì)胞組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)研究

姚紅艷,李秀富,李詩舉,王群輝,歐德淵

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

肥大細(xì)胞(mast cell,MC)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,能分泌多種生物活性物質(zhì),在人類及動物某些速發(fā)變態(tài)反應(yīng)性疾病、寄生蟲感染、生殖、免疫、炎癥反應(yīng)和腫瘤性疾病中具有重要的作用[1]。有研究表明,肥大細(xì)胞與胃腸感覺關(guān)系密切,其中,MC釋放組胺和5-羥色胺(5-HT)能改變神經(jīng)膜電位,使神經(jīng)的興奮性發(fā)生改變;MC釋放的生物活性物質(zhì)如組胺、腦腸肽、前列腺素、細(xì)胞因子和肝素等具有致痛作用[2]。另外,MC脫顆粒釋放的一系列貯存的膜衍生遞質(zhì)(如組胺和5-HT)和新合成的膜衍生遞質(zhì)(如白三烯和前列腺素等)及一些細(xì)胞因子(如IL-6和TNF-α)直接或間接作用于腸道平滑肌來改變腸道運(yùn)動[3]。結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),基于MC的多種生物學(xué)功能,其在小腸中的組織化學(xué)研究具有重要的意義,本試驗(yàn)擬對小鼠小腸MC的組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,以期為MC對小腸的調(diào)節(jié)功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 從貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心購進(jìn)昆明系雌性小鼠20只,體重35 g±3 g。

1.1.2 主要試劑 二甲苯,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司,UN NO:1307;Toluidine Blue,Sino-American Biotec,NO:bs1091;無水乙醇,成都金山化學(xué)試劑有限公司,UN NO:1170;三氯甲烷,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司,UN NO:1888。

1.1.3 主要儀器 自動組織脫水處理機(jī),德國LEICA TP1020;光學(xué)顯微鏡,日本 OLYMPUS CX 31;M ias圖像采集系統(tǒng),四川大學(xué)計(jì)算機(jī)系圖像圖形研究所;旋轉(zhuǎn)式切片機(jī),德國LEICA RM 2125;H 7500透射電子顯微鏡,日本HITACH I公司。

1.2 方法

小鼠頸靜脈放血致死,剖開腹腔,迅速取出空腸中斷,按以下方法操作。

1.2.1 肥大細(xì)胞染色 Carnoy's液固定,常規(guī)包埋,5μm切片,甲苯胺藍(lán)染色,脫水、透明、封片,光鏡觀察并拍照[4]。

1.2.2 透射電鏡研究 100 mL/L多聚甲醛20 mL,25 mL/L戊二醛4 mL,pH 7.4的1mol/L二甲胂酸鹽緩沖液76mL,4℃,1 h。取出切成1mm3的小塊,再用10mL/L戊二醛固定1 h,常規(guī)環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 組織化學(xué)

在光鏡下,MC主要存在于小腸黏膜、黏膜下、肌層和漿膜,在小腸絨毛上皮細(xì)胞間亦見較多MC存在。MC形態(tài)不規(guī)則,呈圓形、橢圓形及不規(guī)則形等,細(xì)胞大小不一,核位于細(xì)胞中心或偏于一側(cè),核不著色呈空泡樣。高倍鏡下(物鏡40倍或100),胞質(zhì)內(nèi)顆粒清晰可見,染色較深,胞漿淡紫紅色,邊界較清(圖1和圖2)。

圖1 箭頭所指為MC(TB×100)Fig.1 Arrow show s the MC(TB×100)

圖2 箭頭所指為MC(TB×400)Fig.2 Arrow show s the MC(TB×400)

2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察

電鏡下,MC主要分布于小腸黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層,絨毛上皮細(xì)胞間亦見有MC分布。MC細(xì)胞形態(tài)各異,胞質(zhì)豐富,充滿大量顆粒,顆粒內(nèi)有大量深染物質(zhì),顆粒有膜包裹,染色較杯狀細(xì)胞深,胞質(zhì)內(nèi)還有空泡狀的結(jié)構(gòu)。核呈橢圓形或略微不規(guī)則形,核仁明顯,異染色質(zhì)貼附于核膜下,核中央有時可見塊狀異染色質(zhì),核質(zhì)比大小不一,胞漿顆粒未見特殊結(jié)構(gòu)(圖3和圖4)。

圖3 MC超微結(jié)構(gòu)(×7 500)Fig.3 The ultrastructure of MC ultrastructure

圖4 MC超微結(jié)構(gòu)(×10 000)Fig.4 The ultrastructure of MC ultrastru cture

3 討論

許多研究表明,MC在調(diào)節(jié)胃腸功能上具有重要的作用。有研究認(rèn)為MC對血管活性腸肽、一氧化氮合成酶呈免疫反應(yīng)陽性[1]。且對調(diào)節(jié)回腸肌肉運(yùn)動起重要作用。MC是免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中的一種關(guān)鍵細(xì)胞,也是胃腸道功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞,參與機(jī)體的多種生理和病理功能調(diào)節(jié)[3]。謝華等[5]認(rèn)為MC的免疫調(diào)節(jié)功能主要通過其釋放的組胺含量來調(diào)節(jié)的,并以神經(jīng)遞質(zhì)和旁遞質(zhì)的方式參與消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的的調(diào)節(jié)。有研究表明,MC與胃腸感覺和蠕動關(guān)系密切[2]。研究者前期的研究表明,不同粉碎情況或不同粒度飼料可通過小腸中肥大細(xì)胞釋放組胺而對營養(yǎng)吸收有不同的影響,而營養(yǎng)物質(zhì)硫酸鋅可通過調(diào)控肥大細(xì)胞生成和釋放組胺同樣具有防止斷奶仔豬腹瀉的作用[6-7]。這均表明肥大細(xì)胞及其介質(zhì)在小腸功能中具有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn),小腸壁內(nèi)MC主要存在于黏膜層、黏膜下層,肌層和漿膜層中均有分布。其接近平滑肌或腸腔,可通過自分泌或旁分泌的途徑調(diào)節(jié)小腸的運(yùn)動或免疫功能。本研究從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了MC具有調(diào)節(jié)小腸功能的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

近年來,人們對MC細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一系列的研究,并取得了一定的進(jìn)展。據(jù)高登慧等[8]報(bào)道,山羊空腸黏膜固有膜中MC多沿黏膜上皮下分布,顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)多樣,超微結(jié)構(gòu)胞漿顆粒外包單位膜不甚清晰,發(fā)現(xiàn)MC胞漿顆粒有蜂窩狀、空泡狀、繩索狀和旋渦狀結(jié)構(gòu)。人MC胞漿顆粒有旋渦狀、顆粒狀和結(jié)晶狀特殊結(jié)構(gòu)[9],豬和鴨等卻未發(fā)現(xiàn)有特殊結(jié)構(gòu)的存在[10]。本研究發(fā)現(xiàn),透射電鏡下,MC呈圓形、橢圓形或不規(guī)則,表面絨毛狀突起不清,核仁明顯。胞質(zhì)豐富,內(nèi)充滿大量特殊的電子密度很大的分泌顆粒,大小均勻較一致,此分泌顆粒有膜包裹,多數(shù)顆粒內(nèi)含有電子密度比較均勻的無定形基質(zhì),染色較杯狀細(xì)胞顆粒深,還可見一些MC因脫顆粒而出現(xiàn)邊緣空隙或遺留空白現(xiàn)象,這些結(jié)構(gòu)的意義還不甚清楚,可能與MC成熟或活化等有關(guān),也可能是脫顆粒不同階段出現(xiàn)的胞漿顆粒形態(tài)學(xué)變化。本研究對小鼠小腸MC超微結(jié)構(gòu)研究中并未發(fā)現(xiàn)小腸MC胞漿顆粒有特殊結(jié)構(gòu)。與光鏡的結(jié)果一樣,MC不僅大量的分布于黏膜層和黏膜下層等,而且在上皮細(xì)胞間亦可見有MC分布,這種分布使MC更容易與腸道中的病原接觸而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究從超微結(jié)構(gòu)上同樣證實(shí),MC在小腸中具有調(diào)節(jié)免疫功能和生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

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