多殺性巴氏桿菌檢測、鑒定和分型研究進(jìn)展

高明燕,徐 步,趙寶華,范建華,龔建森,劉學(xué)賢

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,江蘇揚(yáng)州 225003)

多殺性巴氏桿菌檢測、鑒定和分型研究進(jìn)展

高明燕,徐 步,趙寶華,范建華,龔建森,劉學(xué)賢

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,江蘇揚(yáng)州 225003)

多殺性巴氏桿菌(Pm)可以引起多種畜禽疾病,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了系統(tǒng)的了解Pm檢測、鑒定和分型技術(shù)的發(fā)展,論文主要對Pm的分類地位、鑒定和分型的傳統(tǒng)方法以及分子生物學(xué)方法,諸如種特異性 PCR、莢膜分型PCR、產(chǎn)毒素 Pm 的PCR鑒定、16 S rRNA基因測序法、DNA雜交、大分子圖譜、限制性酶切分析和核糖體分型、隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性、脈沖場凝膠電泳及其他各種基因分型技術(shù)等進(jìn)行了綜述。

多殺性巴氏桿菌;檢測;鑒定;分型

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是重要的人獸共患病病原菌之一,可以引起多種畜禽巴氏桿菌病,如禽霍亂(Fowl cholera)、豬肺疫、豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)、牛和水牛的出血性敗血癥(Hemorrhagic septicemia,HS)、兔鼻瘺(Snuffles)等。人類也可以感染,主要是由動物咬傷或抓傷引起。Pm宿主范圍比較廣泛,引起的疾病表現(xiàn)各異,常常給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫接種是預(yù)防和控制畜禽巴氏桿菌病的有效方法,但由于Pm本身血清型的復(fù)雜性和免疫機(jī)制不甚明了,至今國內(nèi)外尚缺乏理想的疫苗。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)和Pm應(yīng)用基礎(chǔ)研究的發(fā)展,特別是在對Pm的檢測、鑒定和分型方面。

1 多殺性巴氏桿菌的分類地位

在2005年出版的伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(第2版)上,根據(jù)16 S rRNA系統(tǒng)發(fā)育對許多細(xì)菌進(jìn)行了重新分類。多殺性巴氏桿菌仍然屬于巴氏桿菌屬、巴氏桿菌科。巴氏桿菌科位于變形桿菌門、伽馬變形桿菌綱的巴氏桿菌目下。巴氏桿菌科的細(xì)菌種屬有了新的變化,包括6個屬,依次為巴氏桿菌屬、放線桿菌屬、嗜血桿菌屬、曼氏桿菌屬、隆派恩桿菌屬、海豚桿菌屬等;原名溶血性巴氏桿菌改為溶血性曼氏桿菌,是曼氏桿菌屬的代表種;鴨疫里桿菌屬于新建立的里氏桿菌屬,歸于黃桿菌科。而巴氏桿菌屬有20多個種,嚴(yán)格意義上的巴氏桿菌包括P.multocida、P.canis、P.stomatis、P.dagmatis及未命名的species B;但最重要的代表種是多殺性巴氏桿菌(P.multocida)。根據(jù)對海藻糖和山梨醇發(fā)酵模式的不同,Pm又分為3個亞種,分別為多殺亞種、敗血亞種和殺禽亞種。

2 Pm檢測、鑒定和分型的傳統(tǒng)方法

2.1 細(xì)菌分離和表型特征

Pm屬于苛養(yǎng)菌,對營養(yǎng)要求較高。血瓊脂或巧克力瓊脂培養(yǎng)比較好。國外一般用50 mL/L或100 mL/L小?；蜓蜓傊囵B(yǎng),還有許多研究者嘗試過很多別的培養(yǎng)基,如腦心浸液瓊脂(含50 mL/L去纖維綿羊血)、改良Knight's培養(yǎng)基、Pm雙選擇培養(yǎng)基、葡萄糖淀粉瓊脂以及大豆胰酪蛋白瓊脂。國內(nèi)常用的是改良馬丁瓊脂(添加40 mL/L小牛血清、1 g/L的血紅素)。

分離病料以患病動物的內(nèi)臟,如心血、肝臟、脾臟為好,但檢測帶菌動物或潛伏期動物,常用口咽棉拭子或扁桃體棉拭子。另外,有時需要通過接種小鼠進(jìn)行細(xì)菌富集。

Pm的菌落虹彩、形態(tài)、細(xì)菌形態(tài)大小、以及培養(yǎng)和生化特性等表型特征可以參照2005年出版的伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(第2版)。2007年,Christensen H等[1]又重新擴(kuò)展了Pm生化反應(yīng)的項目表,也可用于Pm的準(zhǔn)確鑒定。

2.2 半自動/全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

近年來,半自動/全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)迅速發(fā)展,如法國梅里埃的API系統(tǒng)、VITEK系統(tǒng)、美國BIOLOG系統(tǒng)、英國SENSITITRE系統(tǒng)、BD公司的Phenix System系統(tǒng)、DadeMicroScan公司的MicroScan系統(tǒng)等多種產(chǎn)品。Vera Lizarazo Y A等[2]研究發(fā)現(xiàn)API 20E能鑒定95%的菌株,但是只有60%的菌株可以確定到種的水平;API 50CHB存在更大的差異;API ZYM系統(tǒng)在該菌的鑒定中幫助比較大。Boot R等[3]用API系統(tǒng)對巴氏桿菌科的細(xì)菌進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)比傳統(tǒng)方法更省事更節(jié)省時間,但會出現(xiàn)非特異性引起的假陽性結(jié)果,而且儀器本身及其耗材價格都比較高。國內(nèi)用細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行的研究很多,但在巴氏桿菌方面的應(yīng)用還比較少?？傊?采用半自動/全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)能夠鑒定Pm,但要確定Pm血清型,進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查還是達(dá)不到要求。

2.3 血清學(xué)分型方法

100多年以來,研究者對Pm血清學(xué)分型進(jìn)行了各種嘗試,如凝集和吸附試驗、特異性凝集反應(yīng)、被動血凝試驗、小鼠被動保護(hù)試驗及瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗等。Carter G R[4]用間接血凝試驗將Pm莢膜型分為A、B、D、E 4個血清型;后來又從火雞上鑒定出F型。早期的研究者將特定的莢膜型與特定的宿主疾病及地理位置聯(lián)系在一起,但隨著研究的深入,這種模式越來越不可靠。B型菌株通常引起亞洲牛和水牛出血性敗血癥;E型菌株只在非洲患出血性敗血癥牛上分離到;但近年來,研究者發(fā)現(xiàn),無論在非洲還是世界其他地區(qū)E型菌株都很少分離到;現(xiàn)在非洲牛流行的出血性敗血癥也以 B型為主。禽類主要以A型為主,但在火雞上分離到F型;B、D型也在家禽上分離到,但不致病或癥狀輕微。引起豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎的主要是產(chǎn)毒素的D型;引起豬肺疫的主要是A型;引起牛出血性敗血癥主要為B型。這與我國學(xué)者對多殺性巴氏桿菌的莢膜分型的研究結(jié)果基本一致。

1961年,Namioka S等以1 mol/L的鹽酸處理細(xì)菌,制成菌體抗原,進(jìn)行凝集反應(yīng),將菌體抗原分為12個型;但該方法經(jīng)常會出現(xiàn)交叉反應(yīng)和自家凝集,沒能廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在公認(rèn)的菌體血清學(xué)分型采用的是1972年Heddleston K L建立的耐熱抗原瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗,直到今天,仍然沒有新方法取代該試驗。該法將Pm菌株分為16個(1～16)血清型。豬Pm分離株以1型、2,5型為主。美國和加拿大等主要來源于火雞禽霍亂的血清型為1型、3型、4型;國內(nèi)禽Pm分離株以1型為主,其次還有1,3型、1,14型、3,4型、14型等[5]。傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法雖然費(fèi)時費(fèi)力,但要從事Pm病原學(xué)、流行病學(xué)以及分子生物學(xué)分型等方面的研究,仍然是以傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法為基礎(chǔ)。

2.4 以抗體為基礎(chǔ)的其他檢測方法

除了莢膜血清型、菌體血清型是以抗體為基礎(chǔ)的分型方法外,利用抗體來檢測巴氏桿菌的還有ELISA、對流免疫電泳等方法。Foged N T等建立了針對純化的多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurella multocidatoxin,PMT)單抗的夾心ELISA來檢測產(chǎn)毒素Pm,并采用該法對感染萎縮性鼻炎的豬進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查。如今檢測PMT商業(yè)化的ELISA試劑盒已經(jīng)廣泛用于PAR的診斷和監(jiān)測。針對Pm引起的出血性敗血癥,Prado M E等[5]利用Pm外膜蛋白作為包被原建立的ELISA方法來檢測小牛母源抗體水平。在禽霍亂診斷方面也建立了多種ELISA方法,成熟的商品化ELISA試劑盒已經(jīng)廣泛用于大規(guī)模的家禽血清調(diào)查[4]。鮑娟等[6]采用對流免疫電泳的方法來鑒定豬源Pm血清型,發(fā)現(xiàn)該法特異性高,重復(fù)性好,而且快速,準(zhǔn)確,操作簡便,不需特殊設(shè)備,易于在生產(chǎn)實踐中推廣。

3 Pm分子生物學(xué)檢測、鑒定和分型的方法

Pm的檢測、鑒定和分型長久依賴于實驗室分離培養(yǎng);細(xì)菌純化后,通過諸如形態(tài)學(xué)、糖類發(fā)酵模式和血清學(xué)特征等表型來分類;然而培養(yǎng)條件能夠影響這些特征的表達(dá),從而影響菌株表型鑒定方法的穩(wěn)定性和可靠性。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及Pm70菌株的全基因組和多個單個基因序列的測定,研究人員根據(jù)細(xì)菌的遺傳特征建立多種基因檢測、鑒定和分型的方法。

3.1 Pm全基因組測序法

May B J等[7]報道了禽源Pm70菌株的全基因組序列,發(fā)現(xiàn)Pm70基因組為閉環(huán)單股DNA,共有2 257 487 bp,2 092個基因,預(yù)測編碼2 014個蛋白,6個rRNA操縱子,57個tRNA;其中1 814個開放閱讀框(ORF)可以找到與其他細(xì)菌同源的蛋白或多肽,而有200個ORF是Pm所特有的。

3.2 16 S rRNA基因測序法

細(xì)菌的rRNA有23 S rRNA、16 S rRNA和5S rRNA。16 S rRNA序列含有進(jìn)化速率不同的區(qū)域——可變區(qū)與恒定區(qū),以及多個重復(fù)的核苷酸三聯(lián)體序列;不同種屬的細(xì)菌,其16 S rRNA序列有差異。根據(jù)這些特點(diǎn),16 S rRNA常被用于細(xì)菌種屬的鑒定和分類。Dey S等[8]對來自牛、水牛、豬、綿羊和山羊等宿主Pm B∶2血清型分離株的16 S rRNA序列進(jìn)行比較分析表明,來自不同宿主Pm分離株間16 S rRNA序列同源性高達(dá)99.9%,而且引起不同動物敗血癥B∶2血清型分離株種系發(fā)生關(guān)系很近。Corney B G等[9]采用16 S rRNA測序的方法對Pm進(jìn)行了分析,具有很高的敏感性和特異性。國內(nèi)亓英芳等[10]、賀英等[11]分別對禽、豬等Pm分離株的16 S rRNA序列進(jìn)行了分析,并證實以16 S rRNA為靶基因設(shè)計的PCR方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒定Pm。

3.3 Pm種特異性PCR

PCR方法采用的是設(shè)計1個針對基因組某保守基因的引物,進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增,然后用瓊脂糖凝膠電泳的方法來分離該擴(kuò)增片段,并進(jìn)行大小和序列分析。多殺性巴氏桿菌種特異性PCR(PM-PCR)對Pm的快速診斷意義重大。Townsend K M等[12]利用基因消減的方法對Pm進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了Pm基因組上一個特有區(qū)域,針對該 Pm特異性DNA序列設(shè)計引物,所有的Pm都可以擴(kuò)增出一個460 bp的片段,即PM-PCR。利用該方法成功用于檢測豬扁桃體棉拭子的Pm,36個樣品中有16個陽性,而分離到17個菌株。接種小鼠,有5個陽性結(jié)果沒有分離到Pm,這說明PCR方法敏感性更高。Kalorey D R等[13]采用PM-PCR對印度感染Pm的豬進(jìn)行了成功的診斷,并表明該方法可以快速、敏感、特異的對Pm分離株進(jìn)行鑒定,無需純化樣品。國內(nèi)研究人員對禽、豬、牛等動物分離的Pm用該種特異性PCR進(jìn)行了驗證,都取得了比較確切的診斷效果[14-16]。

3.4 莢膜分型PCR

Townsend K M 等[12]研究表明,A 、B、D、E、F菌株的生物合成位點(diǎn)的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等 ,它們編碼的莢膜多糖成分已經(jīng)通過核磁共振檢查研究證實。Pm A型菌株的莢膜多糖成分是透明質(zhì)酸;B型菌株的莢膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成;D型菌株的莢膜物質(zhì)是一種類似于肝素的多糖。針對這幾種莢膜合成基因位點(diǎn)設(shè)計引物,擴(kuò)增出的片段大小分別為1 044 、760 、657、511、851 bp;由此建立了莢膜分型PCR。該方法也得到國內(nèi)研究者的證實[14-16]。傳統(tǒng)的莢膜分型技術(shù)比較繁瑣,由于體外培養(yǎng)莢膜會消失,所以需要先回歸動物,再重新分離細(xì)菌制備莢膜抗原進(jìn)行間接血凝實驗;Twonsend K M等[12]建立的莢膜PCR分型技術(shù)已經(jīng)基本替代了傳統(tǒng)方法。

3.5 產(chǎn)毒素Pm的PCR鑒定

PM T是引起豬PAR的重要毒力因子,編碼該毒素的是toxA基因。產(chǎn)毒素Pm的PCR方法的建立來自toxA基因的序列測定和克隆。早期的PCR是針對toxA基因的HindⅢ-HindⅢ1.5 kb區(qū)建立的,具有很高的特異性,但是該方法沒有得到廣泛應(yīng)用[4]。Lichtensteiger C A等擴(kuò)增了toxA基因上一個846 bp的片段,此方法區(qū)分產(chǎn)毒素和非產(chǎn)毒素Pm菌株的特異性和敏感性都很高;Dziva F等[17]證實此方法重復(fù)性很好。湯細(xì)彪等[18]根據(jù)產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌的toxA基因序列,設(shè)計了2對特異性引物,擴(kuò)增出兩個片段,分別為864 bp和447 bp,建立了一種能直接從豬鼻拭子中快速檢測產(chǎn)毒素Pm的套式PCR方法,該方法最低能檢出26 cfu,并且快速、方便和靈敏,適合臨床進(jìn)行大規(guī)模病原學(xué)檢測。諸多研究表明PCR診斷技術(shù)在豬PAR檢測和控制研究項目中已經(jīng)成為一個可靠的方法[4]。

3.6 其他基因的PCR

根據(jù)Pm的基因特點(diǎn),研究人員還建立多種用于檢測Pm的PCR,如最近發(fā)展起來的5′Taq核酸酶試驗[9]在Pm野毒株的檢測方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的方法。Miflin J K等建立的PCR,擴(kuò)增了禽和豬Pm分離株的一個1 432 bp大小的片段,并認(rèn)為可以用于禽霍亂和豬巴氏桿菌病的診斷;然而Christensen H 等[19]研究表明P.canisbiovar 2型和P.avium也呈陽性,說明該P(yáng)CR方法的特異性比較低。其他還有針對psl基因、tRNA基因間隔區(qū)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等設(shè)計的PCR方法,這些方法都促進(jìn)了Pm鑒定和檢測研究的發(fā)展。

3.7 DNA雜交

該技術(shù)的首次應(yīng)用是為了診斷豬PAR的toxA基因,設(shè)計的5個雜交探針中只有2個被認(rèn)為有診斷價值[4],但是沒有證據(jù)顯示該探針在野毒擴(kuò)增方面的成功范例。熒光或生物素標(biāo)記的探針用于toxA基因的擴(kuò)增被認(rèn)為有更高的敏感性和特異性?；谪iPAR的二重誘因,研究人員建立了一個可以同時檢測Pm和支氣管敗血波氏桿菌的雙色雜交試驗;并用該試驗評價了84個豬PAR的臨床樣品分離物。直接檢測混合培養(yǎng)物中的Pm可以不必純化該病原菌,從而節(jié)省了時間。Mbuthia P G等[20]用熒光標(biāo)記的rRNA建立了原位雜交試驗,并用于評價禽霍亂感染雞的組織以及人工感染豬的肺組織的檢測。隨著16 S rRNA序列的測定,采用Cy3或熒光標(biāo)記的一個區(qū)域可以將Pm從巴氏桿菌科其他成員中分離出來。研究者認(rèn)為該方法可以成為Pm診斷的一個替補(bǔ)工具。

3.8 大分子圖譜

外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)圖譜是提供相對快速的菌株之間關(guān)系的方法之一。Pm外膜蛋白H和W在凝膠上的電泳移動速率可以作為PAR分離株分型的基礎(chǔ)。Pm的Omp H和熱休克蛋白(OmpA)提供了另一種Omp分型圖譜。依據(jù)這兩個外膜蛋白和其他次要蛋白的電泳分離圖譜將100個禽 Pm分離株分為19種Omp型[21]。莢膜血清型和特異Omp型之間有很強(qiáng)的相關(guān)性,表明Omp圖譜能夠成為一個鑒別Pm菌株的非血清學(xué)技術(shù),而且,通過外膜蛋白分型可以發(fā)現(xiàn)野毒株和疫苗株之間的微小差異。雖然蛋白電泳遷移率的差別能夠作為一個分型的方法,但是具有相同速率的非相關(guān)蛋白可能會造成結(jié)果誤判[4]。

3.9 限制性酶切分析和核糖體分型

限制性酶切分析(restriction endonuclease analysis,REA)是限制性內(nèi)切酶特異性切割細(xì)菌DNA,將不同的菌株切割成不同大小的片段,然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離開來;再用染色劑對凝膠中的片段染色,根據(jù)酶切片段差異的大小對不同的菌株進(jìn)行分型。REA已被證明是細(xì)菌流行病學(xué)研究的一個很有價值的分析手段,也是巴氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查應(yīng)用最頻繁的方法之一,可以鑒別同種菌體血清型或莢膜血清型的分離株[4]。Rimler R B等[22]用該方法對巴氏桿菌分離株進(jìn)行分析,表明REA具有很高的重復(fù)性,不受表型性狀表達(dá)差異的影響,而且比傳統(tǒng)方法具有更好的敏感性和特異性;所使用的限制酶的不同而鑒別水平有所差異,限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和HpaⅠ最適于Pm的研究。

核糖體分型是先用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA,接下來將消化的片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上與標(biāo)記的16 S rRNA或23 S rRNA探針雜交。菌株之間特異性模式的產(chǎn)生及相似性的比較主要取決于所采用的限制性內(nèi)切酶的種類。Dziva F等[17]采用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ?qū)虬筒柬fPm分離株進(jìn)行了分類,發(fā)現(xiàn)該方法可以將1個PAR Pm分離株分為4個不同的核糖體型,每個型還可以分成更細(xì)的亞群;從津巴布韋分離的菌株與從丹麥分離的一個產(chǎn)毒素參考株歸于一群;其結(jié)果與用RAPD方法分析得到的結(jié)果一致。結(jié)果表明,對Pm采用核糖體分型能夠有效區(qū)分不同的菌株,而且進(jìn)一步證實限制性內(nèi)切酶HpaⅡ在Pm核糖體分型中能夠得到比較理想的結(jié)果。

3.10 隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性

隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性(random amplification of polymorphic DNA,RAPD)是一種分子遺傳標(biāo)記技術(shù);其原理是根據(jù)PCR技術(shù),由人工隨機(jī)合成DNA引物,先進(jìn)行2個循環(huán)的隨機(jī)擴(kuò)增,再以低循環(huán)擴(kuò)增的DNA片段作為模版進(jìn)行多個循環(huán)擴(kuò)增,從而產(chǎn)生一些離散的、可重復(fù)的、能反映基因組特征的一些擴(kuò)增片段。該方法快速、簡單,可以在一般實驗室完成,因此被越來越多的用于流行病學(xué)調(diào)查以及實驗室常規(guī)分析和耐藥菌克隆傳播的分析。Dziva F等[16]用該法對核糖體不能分型的Pm進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),該方法區(qū)分Pm分離株的可靠性比較高。劉加波等[23]采用該技術(shù)對9個廣西禽Pm分離株和3個參考株的DNA進(jìn)行了多態(tài)性分析,結(jié)果顯示,廣西流行的菌株呈現(xiàn)多樣性,與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株存在差異,為疫苗的選擇提供了參考依據(jù)。

3.11 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)基本原理是根據(jù)不同大小的DNA片段在一定大小孔徑的瓊脂糖凝膠中,由于電場的不斷變化而改變其泳動方向從而將其分離。該方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為細(xì)菌分子流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)菌溯源的一個“金標(biāo)準(zhǔn)”。利用該方法對患巴氏桿菌病的豬分離株進(jìn)行研究表明,從育種豬口咽分離的D∶2血清型存在多樣性,但是育種豬和仔豬Pm分離株之間沒有遺傳相關(guān)性;從人和豬分離的產(chǎn)毒素Pm菌株的PFGE特征揭示它們之間存在重要的DNA多態(tài)性,但宿主間無明顯相關(guān)性;研究者對引起出血性敗血癥的同一血清型菌株進(jìn)行PFGE分析,可以檢測出菌株間的差異,包括地理相關(guān)性;從北美分離的引起出血性敗血癥的B型菌株與亞洲分離株明顯不同,而且同一地區(qū)的菌株存在高度同源性[24]。Gunarwardana G等[25]在分析鳥源Pm時發(fā)現(xiàn)PFGE方法比基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)的鑒別能力更強(qiáng)。但是該技術(shù)缺點(diǎn)也很明顯,如需要設(shè)備比較昂貴,費(fèi)時,不宜實驗室大量樣本的分析。

3.12 其他基因分型技術(shù)

用于Pm的其他基因分型技術(shù)還有擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、基因芯片技術(shù)、基因組重復(fù)序列PCR(repetitive extragenetic palindormic PCR,REP-PCR)等。

4 結(jié)語

盡管從臨床樣品可以直接進(jìn)行PCR對Pm做快速檢測,但是傳統(tǒng)的表型鑒定技術(shù)有時同樣能夠提供比較確切的檢定結(jié)果。當(dāng)然,將表型特征與基因型方法結(jié)合在一起進(jìn)行分析,結(jié)果將更加確切。更加權(quán)威的鑒定結(jié)果通常需要公認(rèn)的參考菌株做對照,相關(guān)信息可以從美國和英國菌種保藏機(jī)構(gòu)ATCC、NCTC的網(wǎng)站上以及中國菌種目錄[26]一書中獲得。

Pm檢測、鑒定和分型技術(shù)所取得的進(jìn)步,促進(jìn)了Pm相關(guān)種的分類地位和種群結(jié)構(gòu)的鑒定及Pm流行病學(xué)追蹤和地方菌株傳播途徑的研究,而且還為巴氏桿菌的致病性和免疫原性分析研究提供很好的技術(shù)支持。相關(guān)的檢測、鑒定技術(shù)還需要不斷完善,以便能夠完成商業(yè)化開發(fā),從而得到更為廣泛和更加便利的推廣應(yīng)用。除了禽Pm菌株,其他 HS和PAR等菌株的全基因組序列的信息也需要補(bǔ)充?？傊?簡單易行、廉價、快速的鑒定與分型技術(shù)在巴氏桿菌病的診斷和控制中起到了十分重要的作用,可以預(yù)見Pm的檢測、鑒定和分型技術(shù)將會得到進(jìn)一步優(yōu)化,從而為巴氏桿菌病的診斷、監(jiān)測、預(yù)防控制提供更加全面系統(tǒng)的理論與技術(shù)保障。

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Progress on the Detection,Identification and Typing forPasteurella multocida

GAO Ming-yan,XU Bu,ZHAO Bao-hua,FAN Jian-hua,GONG Jian-sen,LIU Xue-xian

(Poultry Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Y angzhou,Jiangsu,225003,China)

Pasteurella multocida(Pm)is responsible for major animal diseases of economic significance in animal husbandry.This paper reviewed and evaluated the advancement of methods of detection,identification and typing to Pm,which include definition of the taxonomical position of Pm,the sequence detection of complete genome and 16S rRNA,species-specific PCR,capsular PCR,PCR detection of toxigenic Pm,DNA hybridization,macromolecular profiling,restriction enzyme analysis and ribotyping,random amplification of polymorphic DNA,pulse-field gel electrophoresis and other typing technology based on genome,and so on.

Pasteurella multocida;detection;identification;typing

S852.612

A

1007-5038(2010)01-0067-06

2009-08-15

江蘇省家禽科學(xué)研究所青年科學(xué)基金項目(S018)

高明燕(1978-),女,山東德州人,助理研究員,碩士,主要從事禽病學(xué)研究。