APE1/Ref－1線粒體定位機制的研究

朱劍武綜述，李夢俠，王 東 審校

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶400042）

APE1/Ref－1是一種重要的多功能蛋白，主要功能是DNA修復和轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)控。目前認為，核編碼基因的線粒體主動轉(zhuǎn)運主要依靠線粒體外膜和內(nèi)膜上一系列轉(zhuǎn)運酶復合體，稱為外膜轉(zhuǎn)運酶（translocase of outer membrane，TOM）和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運酶（translocase of inner membrane，TIM）?；具^程為線粒體外膜TOM復合體中的受體亞基，包括TOM20、TOM22和TOM70識別前體蛋白上的線粒體定位信號，而后通過TOM40等亞基形成的共同轉(zhuǎn)運通道（general import pore，GIP）進入線粒體［1］。前體蛋白與不同的受體TOM蛋白結(jié)合，通過兩類主要的轉(zhuǎn)運機制進入線粒體［2］：（1）位于N端的線粒體定位序列（MTS）與TOM20、TOM22結(jié)合，是大多數(shù)線粒體定位基因的轉(zhuǎn)運途徑；（2）位于蛋白內(nèi)部的信號肽與TOM70結(jié)合，主要是一類載體蛋白的轉(zhuǎn)運途徑［3］。本文從APE1/Ref－1的線粒體定位序列入手，闡明線粒體外膜TOM復合體識別 MTS的機制，并進一步探討APE1/Ref－1的線粒體轉(zhuǎn)位和干擾其線粒體定位的機制。

1 APE1/Ref－1在線粒體氧化應激反應中的作用

1.1APE1/Ref－1與氧化應激損傷 APE1/Ref－1是 DNA 堿基切除修復（BER）關(guān)鍵的限速酶，同時作為主要的AP核酸內(nèi)切酶具有修復 AP位點和氧化還原雙重功能［4］；另一方面APE1具有獨特的氧化還原活性，通過控制DNA氧化還原狀態(tài)的結(jié)合域調(diào)控某些轉(zhuǎn)錄因子的DNA親和力［5］。DNA受活性氧（reactive oxygen species，ROS）攻擊后形成 AP位點，從而導致DNA復制障礙或發(fā)生遺傳變異。APE1/Ref－1作為核酸內(nèi)切酶參與修復ROS引起的DNA損傷，在ROS誘導的疾病治療中起關(guān)鍵作用。在認識到ROS在信號轉(zhuǎn)導中起著核心作用之前，氧化應激被認為是促氧化劑和抗氧化劑之間的失衡，現(xiàn)在氧化應激被更多地認為是氧化還原信號轉(zhuǎn)導和控制之間的紊亂［6］。ROS是生物體進行有氧呼吸時產(chǎn)生的副產(chǎn)品，外源性環(huán)境致癌物和電離輻射等因素也能誘導ROS的產(chǎn)生。ROS包括O2－、OH－、H2O2、ONOO－等，它們通常導致膜磷脂、膜蛋白、DNA堿基等的氧化性損傷和AP位點的形成，與心臟衰竭、腦局部缺血損傷、神經(jīng)變形性疾病和衰老等病變過程密切相關(guān)［7］。生物體在受到外源性環(huán)境致癌物和電離輻射等刺激后，誘導產(chǎn)生大量ROS。ROS廣泛攻擊膜磷脂、膜蛋白、胞漿蛋白和 DNA，導致細胞的氧化性應激損傷［8］。APE/Ref－1能調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AP－1的氧化還原活性，還原被氧化的AP－1，恢復其DNA結(jié)合活性。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS能夠激活在CHO細胞中轉(zhuǎn)染的APE1/Ref－1啟動子，而且通過定點突變發(fā)現(xiàn)，使CREB結(jié)合位點失活能夠使H2O2對于APE1/Ref－1啟動子的激活失效。不僅如此，APE1/Ref－1的表達水平可以作為細胞氧化應激狀態(tài)的標志分子，因此了解ROS誘導的細胞調(diào)控機制中信號通路的組成十分重要。

1.2APE1/Ref－1與線粒體氧化應激反應 APE1/Ref－1是一種在哺乳動物中高度保守的蛋白。在漫長的進化過程中，APE1和Ref－1這2個具有截然不同功能的亞基逐漸聚集到一起，形成一個密不可分的功能復合體，在細胞核內(nèi)DNA損傷和氧化還原雙功能都參與氧化應激后基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，因此APE1/Ref－1可能不僅具有線粒體DNA修復活性，而且很可能具有氧化還原功能［9］。APE1在線粒體氧化應激反應中的重要作用得到廣泛關(guān)注，以往研究表明，APE1蛋白水平在線粒體中表達量少，也就是說，常規(guī)的免疫技術(shù)很難定位檢測它的表達水平［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)，APE1可以在氧化應激等情況下轉(zhuǎn)位至線粒體，而其理化性質(zhì)決定APE1不能通過被動轉(zhuǎn)運進入線粒體，說明該轉(zhuǎn)位過程必定涉及主動轉(zhuǎn)運途徑。當線粒體受到不同的氧化應激物刺激時，如過氧化氫環(huán)境下，APE1在線粒體中的表達水平將明顯增高，并與刺激物劑量相關(guān)且具有時間依賴性［11］。因此APE1的線粒體靶向定位應該是有先決條件的。有研究表明，抑制APE1的氧化還原功能將阻止鼠內(nèi)皮細胞生長及血管發(fā)生，同時對人腫瘤細胞的血管發(fā)生及生長也有抑制作用［12］。APE1的生物學重要性在于APE1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出胚胎致命性［13］。由于APE1的生物學活性都是與DNA損傷修復相關(guān)，目前研究發(fā)現(xiàn)，APE1蛋白主要定位于細胞核，但在氧化應激等刺激下可轉(zhuǎn)位至線粒體基質(zhì)，但其機制仍不明了，因此研究APE1/Ref－1分子與線粒體的氧化應激反應的調(diào)節(jié)機制顯得十分重要。

2 APE1/Ref－1的線粒體轉(zhuǎn)運機制

2.1線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運機制 mtDNA為環(huán)狀雙鏈DNA分子，雖然線粒體也能合成蛋白，但是合成能力有限。在線粒體1 000多種蛋白中，自身合成的僅10余種，編碼37個基因產(chǎn)物，其中13種蛋白，包括1個細胞色素B基因，2個ATP酶復合體組成成分基因，3個細胞色素C氧化酶亞單位的基因及7個呼吸鏈NADH脫氫酶亞單位的基因；2個rRNA基因；還有22個tRNA基因［14］。絕大多數(shù)的線粒體蛋白是核基因所編碼的并易位到線粒體。近年來蛋白跨膜運送研究有很大的進展，主要在于：（1）無論外、內(nèi)膜都發(fā)現(xiàn)不少組成運送機器的膜蛋白［15］，其中個別蛋白已分離、純化和重組于脂質(zhì)體，并表現(xiàn)其功能［16］；（2）在跨膜運送前后有不止一種的“分子伴侶”參與，對運送過程起著重要的作用。分子伴侶在信號轉(zhuǎn)導中也有重要作用。當細胞未受到激素刺激時，受體同分子伴侶結(jié)合在一起，核定位信號（nuclear localization signal，NLS）和 DNA 結(jié)合位都被隱蔽起來。當細胞受到信號分子的作用，脂溶性的激素進入細胞質(zhì)，同相應受體上的激素結(jié)合位點結(jié)合，使受體同分子伴侶脫離，露出核定位信號和DNA結(jié)合位點。然后核定位蛋白通過核孔（nuclear pore）進入細胞核（nuclear）DNA結(jié)合位點，同染色體上的DNA結(jié)合，啟動基因表達［17］。

2.2線粒體定位蛋白的運送途徑 線粒體具有4個功能區(qū)隔，即外膜、內(nèi)膜、膜間隙、基質(zhì)，進入不同部位的蛋白具有不同的轉(zhuǎn)運途徑。進入外膜的蛋白具有不被切除的N端信號序列，其后還有疏水性序列作為停止轉(zhuǎn)移序列，然后蛋白被TOM復合體安裝到外膜上，如線粒體的各類孔蛋白。進入基質(zhì)的蛋白可以先通過TOM復合體進入膜間隙，然后通過TIM復合體進入基質(zhì)，也可以通過線粒體內(nèi)、外膜間的接觸點進入基質(zhì)，在接觸點上TOM與TIM協(xié)同作用完成蛋白向基質(zhì)的輸入，最后內(nèi)膜的基質(zhì)面上由ATP耦聯(lián)的線粒體熱休克蛋白70（mtHsp70）可以促進線粒體蛋白向基質(zhì)轉(zhuǎn)運的完成［18］。值得注意的是，在轉(zhuǎn)運過程中線粒體蛋白都是以前體蛋白的形式存在，大多數(shù)是線性形式，經(jīng)過轉(zhuǎn)運復合體后進入線粒體的前體蛋白由線粒體的基質(zhì)作用蛋白酶（matrix processing peptidase，MPP）切除前導序列，并在諸如熱休克蛋白60（Hsp60）之類的分子伴侶的輔助下重新折疊成為活性蛋白。

線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運涉及多種蛋白復合體，由受體和蛋白通過的孔道兩部分構(gòu)成。主要包括：（1）TOM復合體，負責通過外膜，進入膜間隙，在酵母中TOM70負責轉(zhuǎn)運內(nèi)部具有信號序列的蛋白，TOM20負責轉(zhuǎn)運N端具有信號序列的蛋白。TOM復合體的通道被稱為GIP，主要由TOM40構(gòu)成，還包括TOM22、TOM7、TOM6 和 TOM5。（2）TIM 復合體，其中TIM23負責將蛋白轉(zhuǎn)運到基質(zhì)，也可將某些蛋白安插在內(nèi)膜；TIM22負責將線粒體的代謝物運輸?shù)鞍?，如ADP/ATP和磷酸的轉(zhuǎn)運蛋白插入內(nèi)膜。（3）OXA復合體，負責將線粒體自身合成的蛋白插到內(nèi)膜上，同樣也可使經(jīng)由TOM/TIM復合體進入基質(zhì)的蛋白插入內(nèi)膜。

2.3APE1/Ref－1的線粒體轉(zhuǎn)運機制 據(jù)文獻報道，不同長度的截短型APE1真核表達載體，并轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中以激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞內(nèi)定位［19］。由于綠色熒光蛋白的激發(fā)發(fā)光需要其正確折疊形成的構(gòu)象，因此在這一折疊過程中很可能影響了APE1殘余序列的正確折疊，導致無法與線粒體外膜受體TOM蛋白相互識別而影響特異性的轉(zhuǎn)位［20］。線粒體前體蛋白與不同的受體TOM蛋白結(jié)合，通過兩類主要的轉(zhuǎn)運機制進入線粒體［21］：（1）位于N端的線粒體定位序列（MTS）與TOM20、TOM22結(jié)合，是大多數(shù)線粒體定位基因的轉(zhuǎn)運途徑；（2）位于蛋白內(nèi)部的信號肽與TOM70結(jié)合，主要是一類載體蛋白的轉(zhuǎn)運途徑［22］。核編碼的線粒體定位前體蛋白均由線粒體表面受體識別，隨后通過GIP將線粒體定位蛋白轉(zhuǎn)位到外膜上（TOM）［23］。TOM 復合體主要由 TOM20、TOM22和TOM70等3個亞基構(gòu)成，主要負責轉(zhuǎn)運內(nèi)部具有信號序列的蛋白，通過外膜，進入膜間隙。在體外純化這3種受體蛋白的胞質(zhì)便可確定特異的線粒體前體蛋白。線粒體輸入蛋白研究表明，TOM20和TOM22是異二聚體受體，功能是轉(zhuǎn)運攜帶裂解N－末端線粒體定位序列（MTS）的典型的線粒體前體蛋白。據(jù)文獻報道，TOM70是負責將線粒體非裂解前體蛋白向內(nèi)膜轉(zhuǎn)運所必須的特異受體蛋白［24］。因此進一步研究APE1線粒體定位序列（MTS）與線粒體外膜上TOM蛋白受體結(jié)合的作用區(qū)域至關(guān)重要。

3 APE1/Ref－1的MTS線粒體定位機制

3.1APE1/Ref－1的MTS特征線粒體定位蛋白APE1/Ref－1與線粒體特異的靶蛋白不同，它被認為是一個雙定位的線粒體蛋白，主要定位于胞核，可以在氧化應激等情況下轉(zhuǎn)位至線粒體，且主要分布在線粒體細胞核內(nèi)。然而APE1的線粒體定位機制尚不明確。APE1相對分子質(zhì)量偏大，無法通過被動擴散的方式進入線粒體，此外由于其線粒體移位發(fā)生于線粒體膜電位改變之前，不可能通過線粒體外膜通透性增加來滲入線粒體，因此普遍認為APE1的線粒體轉(zhuǎn)位是通過主動轉(zhuǎn)運的方式進入的。目前的生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，APE1蛋白并無典型的N端MTS，而其同源蛋白APE2卻具有明確的MTS［25］，故早期研究認為，線粒體中的 APE活性主要是由APE2產(chǎn)生的，但是經(jīng)后期研究發(fā)現(xiàn)，APE2與APE1同源性較低，且APE活性極弱，直至研究人員通過蛋白組學的方法在線粒體提取物中發(fā)現(xiàn)APE1蛋白才確證APE1是存在于線粒體中的主要AP核酸內(nèi)切酶。對APE1/Ref－1N－末端序列仔細分析發(fā)現(xiàn)，并不存在典型的MTS，卻具有典型的細胞核定位信號（NLS），有研究表明，APE1線粒體定位的前提條件即去掉N端的NLS，證明其線粒體定位信號肽可能存在于除N端之外的其余序列之中。Qu等［26］認為線粒體定位信號可能存在于靠近C端的某個區(qū)域內(nèi)，但是并未具體說明其范圍和序列特征。Dinur－Mills等［27］發(fā)現(xiàn)，雙定位的線粒體蛋白有較弱的MTS，且蛋白整體凈電荷較低。APE1/Ref－1蛋白含有一個非常規(guī)的定位信號，利用傳統(tǒng)生物信息學的方法極有可能逃脫預測。

3.2APE1/Ref－1的MTS與TOM蛋白結(jié)合特性 線粒體外膜轉(zhuǎn)運復合體TOM介導的轉(zhuǎn)運嚴格依靠在胞漿核糖體中合成的前體蛋白中所攜帶的一段氨基酸序列，這種線粒體定位蛋白的前導序列被稱為MTS，通過線粒體定位信號肽與線粒體外膜上受體的結(jié)合使前體蛋白定位于線粒體的表面，并穿過線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)，最終到達線粒體基質(zhì)。以往利用一些計算機預測軟件對線粒體亞細胞定位進行搜索預測，包括常用的預測軟件MitoProt和TargetP均顯示，APE1的MTS預測分數(shù)很低。有報道稱，APE1主要被TOM20識別，表明APE1的線粒體易位可能通過TOM20依賴途徑介導。TOM20識別一種位于N－末端裂解的線粒體前體蛋白信號序列MTS，此序列信號是具有兩親性螺旋的疏水氨基酸殘基［28］。有學者認為，APE1的MTS是位于C－末端的尾錨定性前體蛋白。線粒體尾錨定性前體蛋白，包括Bcl－2和TOM20，它們經(jīng)C－末端跨膜區(qū)插入到線粒體外膜［29］。雖然APE1在線粒體中尚無確切的定位特征性，但根據(jù)APE1的修復功能，它應該是伴隨線粒體DNA分布在線粒體基質(zhì)中。

通過多肽陣列掃描比較預測MTS與TOM蛋白親和力的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合有強大約束力的TOM蛋白的多肽遍布在整個蛋白中，很難確定APE1真實的MTS，結(jié)果只突出了一些可能的截短型APE1信號序列。TOM的3個受體蛋白對特定的線粒體靶蛋白表現(xiàn)出不同的親和力。然而當與純化的多肽相互作用時這些TOM受體蛋白表現(xiàn)出重疊的親和力［30］。最值得注意的是，位于APE1的N－末端的位點K299、R301和K303只要發(fā)生丙氨酸置換突變便會減少肽與TOM20的親和力［19］。更有趣的是，K24、K25、K27和 K31殘基替換可增強TOM20親和力。由于它們位于APE1的N－末端，這些特定的賴氨酸殘基可能會抑制APE1的線粒體分布［19］。通過觀察截短型APE1的亞細胞分布檢測這些可能的定向序列，發(fā)現(xiàn)當N－末端的長序列包含在截短型APE1蛋白中，線粒體靶向作用非特異性。如果除掉大部分N－末端序列后，截短型APE1蛋白便具有線粒體特異的靶作用。雖然在C－末端它們均包含MTS，但似乎被隱藏在APE1蛋白的核心中，因此很難在線粒體表面接觸到TOM蛋白，由此可以推斷，APE1/Ref－1會靶向氧化應激后的線粒體，其中一個最可能的機制是細胞氧化還原失衡改變了APE1蛋白完整的N－末端構(gòu)象，這種改變使氧化還原功能得以發(fā)揮并暴露出MTS與線粒體外膜上TOM蛋白接觸區(qū)域。綜上所述，通過分析亞線粒體組分研究APE1的線粒體定位，將有助于闡明其線粒體定位機制，為氧化應激后通過干擾APE1線粒體轉(zhuǎn)位以促進細胞凋亡為目的提供新的靶向治療策略。

4 小 結(jié)

APE/Ref－1是典型的雙定位的復雜的生物大分子，在多種氧化應激刺激下它可以易位到線粒體發(fā)揮效應。隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展，硅片法芯片技術(shù)為APE1的N－末端NLS的鑒定提供了新的契機。盡管目前的生物信息學方法尚無法確定APE1的MTS，但相信聯(lián)合蛋白組學和實驗室檢測方法研究TOM蛋白和APE1/Ref－1的 MTS間的相互作用，可以為更好地理解APE1/Ref－1這個多功能生物大分子提供新的思路，有助于為進一步以APE1/Ref－1線粒體定位序列為靶點的基因治療奠定良好的基礎(chǔ)。

［1］Chacinska A，Laan M，Mehnert CS，et al.Distinct forms of mitochondrial TOM－TIM super－complexes define signaldependent states of preprotein sorting［J］.Mol Cell Biol，2010，30（1）：307.

［2］Eliyahu E，Pnueli L，Melamed D，et al.Tom20mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation－dependent manner［J］.Mol Cell Biol，2010，30（1）：284.

［3］Budzińska M，Gatgańska H，Karachitos A，et al.The TOM complex is involved in the release of superoxide anion from mitochondria［J］.J Bioenerg Biomembr，2009，41（4）：361.

［4］Mol CD，Izumi T，Mitra S，et al.DNA－bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1DNA repair and coordination［J］.Nature，2000，403（6768）：451.

［5］Yang S，Misner BJ，Chiu RJ，et al.Redox effector factor－1，combined with reactive oxygen species，plays an important role in the transformation of JB6cells ［J］.Carcinogenesis，2007，28（11）：2382.

［6］Jones DP.Redefining oxidative stress［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8（9210）：1865.

［7］Tsutsui H，Kinugawa S，Matsushima S.Oxidative stress and mitochondrial DNA damage in heart failure［J］.Circ J，2008，72（8）：1347.

［8］Prakash S，Johnson RE，Prakash L.Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases：specificity of structure and function［J］.Annu Rev Biochem，2005，74：317.

［9］Breit JF，Ault－Ziel K，Al－Mehdi AB，et al.Nuclear protein－induced bending and flexing of the hypoxic response element of the rat vascular endothelial growth factor promoter［J］.Faseb J，2008，22（1）：19.

［10］Santos JH，Hunakova L，Chen Y，et al.Cell sorting experiments link persistent mitochondrial DNA damage with loss of mitochondrial membrane potential and apoptotic cell death［J］.J Biol Chem，2003，278（3）：1728.

［11］Kow YW.Repair of deaminated bases in DNA［J］.Free Radic Biol Med，2002，33（7）：886.

［12］Stuart JA，Brown MF.Mitochondrial DNA maintenance and bioenergetics［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757（2）：79.

［13］Wiesner RJ，Zsurka G，Kunz WS.Mitochondrial DNA damage and the aging process：facts and imaginations［J］.Free Radic Res，2006，40（12）：1284.

［14］Dagley MJ，Dolezal P，Likic VA，et al.The protein import channel in the outer mitosomal membrane of Giardia intestinalis［J］.Mol Biol Evol，2009，26（9）：1941.

［15］Rone MB，Liu J，Blonder J，et al.Targeting and insertion of the cholesterol－binding translocator protein into the outer mitochondrial membrane［J］.Biochemistry，2009，48（29）：6909.

［16］Bolender M，Sickmann A，Wagner R，et al.Multiple pathways for sorting mitochondrial precursor proteins［J］.Embo，2008，9（61）：42.

［17］Dianov GL，Souza－Pinto N，Nyaga SG，et al.Base excision repair in nuclear and mitochondrial DNA［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，2001，68（3）：285.

［18］Jezek P，Plecitá－HlavatáL.Mitochondrial reticulum network dynamics in relation to oxidative stress，redox regulation，and hypoxia［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（10）：1790.

［19］Li MX，Zhong ZY，Zhu JW，et al.Targeting truncated APE1in mitochondria enhances cell survival after oxidative stress［J］.Free Radical Biology and Medicine，2008，45（5）：592.

［20］李夢俠，王東.APE1/Ref－1基因結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控［J］.醫(yī)學分子生物學雜志，2006，3（5）：350.

［21］Cheng TL，Liao CC，Tsai WH，et al.Identification and characterization of the mitochondrial targeting sequence and mechanism in human citrate synthase［J］.J Cell Biochem，2009，107（5）：1002.

［22］Yamamoto H，F(xiàn)ukui K，Takahashi H，et al.Roles of Tom70in import of presequence－containing mitochondrial proteins［J］.J Biol Chem，2009，284（46）：31635.

［23］Li MX，Zhong ZY，Zhu JW，et al.Identification and characterization of mitochondrial targeting sequence of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1［J］.J Biol Chem，2010，10：1074.

［24］Chan NC，Likic VA，Waller RF，et al.The C－terminal TPR domain of Tom70defines a family of mitochondrial protein import receptors found only in animals and fungi［J］.J Mol Biol，2006，358（4）：1010.

［25］Tsuchimoto D，Sakai Y，Sakumi K，et al.Human APE2 protein is mostly localized in the nuclei and to some extent in the mitochondria，while nuclear APE2is partly associated with proliferating cell nuclear antigen［J］.Nucle－ic Acids Res，2001，29（11）：2349.

［26］Qu J，Liu GH，Huang B，et al.Nitric oxide controls nuclear export of APE1/Ref－1through S－nitrosation of cysteines 93and 310［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（8）：2522.

［27］Dinur－Mills M，Tal M，Pines O.Dual targeted mitochondrial proteins are characterized by lower MTS parameters and total net charge［J］.Plos One，2008，3（5）：2161.

［28］高文祥，陳建，高鈺琪.線粒體蛋白轉(zhuǎn)運的研究進展［J］.重慶醫(yī)學，2006，35（19）：1795.

［29］Ott M，Norberg E，Zhivotovsky B，et al.Mitochondrial targeting of tBid/Bax：a role for the TOM complex［J］.Cell Death Differ，2009，16（8）：1075.

［30］Singh KK，Kulawiec M，Still I，et al.Inter－genomic cross talk between mitochondria and the nucleus plays an important role in tumorigenesis［J］.Gene，2005，354（18）：140.