過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ在大鼠氣道黏液高分泌中的表達(dá)及意義＊

張湘燕，劉維佳，姚紅梅，馮端興，張 程

（貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴陽(yáng)550002）

呼吸道過(guò)度分泌黏液和黏液成分改變所致的黏稠度增加可引起氣流阻塞和呼吸道反復(fù)感染。近年來(lái)研究證明，氣道黏液高分泌增加了慢性氣道疾病的住院率及病死率，是影響病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。由于目前尚無(wú)治療氣道黏液高分泌特異有效的藥物，因此進(jìn)一步闡明氣道黏液高分泌的發(fā)生機(jī)制，將有助于干預(yù)氣道黏液調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，有效控制氣道黏液高分泌。本研究以大鼠為研究對(duì)象，探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）在內(nèi)毒素誘導(dǎo)氣道黏液高分泌中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 內(nèi)毒素E.coli 055∶B5（美國(guó)Sigma公司）、黏蛋白5AC（MUC5AC）單克隆抗體（美國(guó)Neomarkers公司）、PPAR－γ多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、免疫組化染色SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）、Taq DNA聚合酶及dNTP（美國(guó)Promega公司）等。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量200～220g，鼠齡10～12周，隨機(jī)分為對(duì)照組和內(nèi)毒素組。對(duì)照組以1%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射，麻醉生效后切開(kāi)頸部皮膚，暴露氣管，向氣管內(nèi)注入生理鹽水100μL，隨后將大鼠直立，并輕輕晃動(dòng)1～2min。內(nèi)毒素組操作方法同前，參考Yanagihara等［2］的方法，氣管內(nèi)注入濃度為2g／L的LPS 100μL。

1.3 標(biāo)本收集 氣管注藥后第4天，腹腔注射1%戊巴比妥鈉50mg／kg麻醉大鼠，取其右中肺置于4%甲醛中固定，剪取靠近中心氣道的其余右肺組織置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 氣道上皮杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)及黏液物質(zhì)測(cè)定 采用HE及阿辛藍(lán)－過(guò)碘酸雪夫（AB－PAS）染色進(jìn)行杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)及檢測(cè)氣道黏液物質(zhì)表達(dá)。于光鏡（×200）下采集5個(gè)完整的支氣管橫斷面圖像，計(jì)算杯狀細(xì)胞占所有上皮細(xì)胞的比例，并采用積分法進(jìn)行半定量分析，杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞比例：＜5%為0分；≥5～25%為1分；＞25～50%為2分；＞50～75%為3分，＞75%為4分。應(yīng)用IMAGE－Pro plus4.5圖像分析系統(tǒng)以相對(duì)著色面積表示氣道黏液物質(zhì)的表達(dá)。

1.5 氣道及肺組織MUC5AC、PPAR－γ蛋白測(cè)定 用免疫組化鏈菌素過(guò)氧化物酶連接（SP）法檢測(cè)氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ表達(dá)。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。高倍鏡下觀察MUC5AC為胞漿顯色，PPARγ為胞核顯色。應(yīng)用IMAGE－Pro plus4.5進(jìn)行圖像分析，以平均積分光密度為指標(biāo)對(duì)免疫組化染色進(jìn)行定量分析。

1.6 檢測(cè)氣道及肺組織 MUC5AC、PPARγmRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)定量PCR（real－time PCR）檢測(cè) MUC5AC、PPARγmRNA表達(dá)。取靠近中心氣道及右肺組織，用Trizol常規(guī)一步法提取氣道及肺組織總RNA。按cDNA合成試劑盒說(shuō)明配置反應(yīng)體系，在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA，以此為模板分別加入 MUC5AC、PPARγ、甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）引物及熒光染料在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性2min，94℃變性20s，50℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，共40次，72℃再延伸5min。MUC5AC引物序列：上游引物5′－TCC TTC TTG TCA ATG GTG TCT－3′，下游引物5′－ACC AGG TTC AGG ACA AGT AG－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為151 bp。PPAR－γ引物序列：上游引物5′－GTC TCA CAA TGC CAT CAG GTT－3′，下游引物5′－TTC AGC TGG TCG ATA TCA CT－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為90bp。GAPDH引物序列：上游引物5′－CCT CAA GAT TGT CAG CAA T－3′，下游引物5′－CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為141bp。上述引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度的時(shí)相統(tǒng)一設(shè)定在擴(kuò)增反應(yīng)退火期，采用50℃、30s作為退火期。測(cè)定各樣品循環(huán)閾值（Ct值），并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，計(jì)算目的基因相對(duì)于管家基因的定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氣道上皮杯狀細(xì)胞及黏液物質(zhì)的變化 與對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組氣道上皮杯狀細(xì)胞積分及氣道黏液物質(zhì)的表達(dá)明顯增加（表1）。

表1 兩組大鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞積分及黏液物質(zhì)變化（±s，n＝6）

表1 兩組大鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞積分及黏液物質(zhì)變化（±s，n＝6）

＊：與對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別 杯狀細(xì)胞積分（分） AB－PAS染色陽(yáng)性相對(duì)著色面積（%）對(duì)照組0.50±0.11 4.18±0.70內(nèi)毒素組 2.73±0.33＊ 56.49±9.57＊

2.2 氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達(dá)MUC5AC陽(yáng)性染色顆粒主要見(jiàn)于支氣管黏膜上皮，部分見(jiàn)于黏膜下腺體（插頁(yè)Ⅰ圖1、2）。與對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組氣道及肺組織MUC5AC蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加。PPARγ陽(yáng)性染色顆粒主要見(jiàn)于氣道上皮細(xì)胞、氣道及肺泡周?chē)?rùn)的炎癥細(xì)胞。與對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組氣道及肺組織PPAR－γ蛋白及mRNA表達(dá)增加（表2）。

2.3 相關(guān)性分析 內(nèi)毒素組氣道及肺組織PPARγ蛋白表達(dá)水平與氣道及肺組織MUC5AC mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.829，P＜0.05）。

表2 兩組大鼠氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達(dá)（±s，n＝6）

表2 兩組大鼠氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達(dá)（±s，n＝6）

＊：與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別MUC5AC平均積分光密度 相對(duì)拷貝數(shù)PPARγ平均積分光密度 相對(duì)拷貝數(shù)對(duì)照組 1785.00±236.05 2.42±0.68 825.84±107.02 2.23±0.53內(nèi)毒素組 3998.95±513.13＊ 39.03±9.43＊ 1121.08±202.53＊ 6.00±1.44＊

3 討 論

氣道黏液主要由氣道上皮杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體分泌，適量黏液分泌對(duì)保持黏膜濕潤(rùn)、防御病原微生物和有害物質(zhì)的侵入及維持黏液纖毛清除功能具有重要作用。黏蛋白（mucin，MUC）質(zhì)和量的變化對(duì)黏液的黏彈性起主要作用，其中由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的MUC5AC不管是在健康個(gè)體還是氣道疾病患者都是氣道分泌黏液中最主要的黏蛋白成分［3］。MUC過(guò)度表達(dá)、氣道上皮杯狀細(xì)胞、黏液分泌細(xì)胞增生與化生以及貯存的黏蛋白分泌增多是氣道黏液高分泌發(fā)生的主要病理機(jī)制。許多因素，如空氣污染物、細(xì)菌成分、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等都可增加氣道上皮細(xì)胞MUC表達(dá)，導(dǎo)致氣道黏液高分泌。由于細(xì)菌感染是慢性氣道疾病發(fā)生、發(fā)展和反復(fù)加重的重要因素，尤其革蘭陰性菌是最主要的致病菌之一，因此感染對(duì)MUC表達(dá)信號(hào)通路的調(diào)控倍受關(guān)注。

PPARγ于1990年由Issemann和Green［4］首先從小鼠肝臟克隆出來(lái)，是一類(lèi)由致密分子構(gòu)成依賴(lài)配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是與配體結(jié)合后通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)引起蛋白合成和使生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生改變。早期研究認(rèn)為，PPARγ的功能僅限于調(diào)控脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)和糖代謝。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ除具有調(diào)節(jié)脂肪代謝、糖代謝、細(xì)胞分化凋亡等生物學(xué)效應(yīng)外，還可能參與炎癥控制并具有免疫調(diào)節(jié)作用［5］。對(duì)呼吸系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，氣道上皮、支氣管黏膜下層和氣道平滑肌均有 PPARγ表達(dá)，可能與慢性氣道炎癥有關(guān)［6－7］。Birrel等［8］對(duì)大鼠預(yù)先給予PPARγ激動(dòng)劑——羅格列酮處理，能明顯減少內(nèi)毒素（LPS）刺激引起的氣道中性粒細(xì)胞聚集和多種細(xì)胞因子的釋放。在哮喘的動(dòng)物模型中，霧化吸入羅格列酮后可使IL－2、IL－4和IFN－γ等細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，肺部炎癥減輕，黏液分泌減少［9］。本研究結(jié)果顯示，在正常大鼠氣道及肺組織有少量PPARγ蛋白及mRNA表達(dá)，氣管內(nèi)注射LPS后氣道上皮杯狀細(xì)胞、氣道黏液物質(zhì)、氣道及肺組織MUC5AC蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加，機(jī)體出現(xiàn)氣道黏液高分泌改變，同時(shí)氣道PPARγ蛋白及mRNA表達(dá)亦有所增加。表明LPS作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，侵入機(jī)體后可刺激氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)目增多，上調(diào)氣道上皮細(xì)胞MUC基因MUC5AC的表達(dá)，促進(jìn)MUC的合成，而PPARγ參與了細(xì)菌誘導(dǎo)氣道黏液高分泌的發(fā)生。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示，氣道及肺組織PPARγ蛋白表達(dá)水平與氣道及肺組織MUC5AC mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌可能存在負(fù)性調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機(jī)制是否與PPARγ的抗炎作用有關(guān)尚待深入研究。

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