SUMO－1mRNA診斷肝癌的價值研究＊

郭武華，袁麗華，肖志華，羅良平，余 婷，張吉翔△

（南昌大學第二附屬醫(yī)院／江西省分子生物重點實驗室：1.腫瘤科；2.消化科 330006）

SUMO－1基因是 SUMO（small ubiquitin－like modifier）基因家族中的一員，主要參與蛋白質(zhì)翻譯后功能的修飾，在轉(zhuǎn)錄、DNA修復、核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運及染色體分離等方面發(fā)揮重要作用［1－2］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，SUMO－1的修飾調(diào)節(jié)了許多與癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白的功能，如p53、增殖細胞核抗原、雌激素受體、端粒酶等［3－7］，提示 SUMO－1基因與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，SUMO－1基因在肝癌細胞株SMMC－7721、HepG2、Hep3B以及臨床肝癌標本中均明顯高表達，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達較低［8］。本實驗通過檢測臨床肝癌、肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標本中SUMO－1mRNA表達水平，以進一步評價SUMO－1基因診斷肝癌的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 肝癌、癌旁肝組織、肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標本均來自本院外科2007年11月至2008年12月行肝切除患者，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。共檢測20例，其中男16例，女4例。肝細胞性肝癌術(shù)前甲胎蛋白（AFP）＜8.0 ng／mL（本院正常值上限）4例，肝細胞性肝癌術(shù)前AFP＞400 ng／mL 4例；肝內(nèi)膽管細胞癌4例，肝血管瘤7例，肝局灶性結(jié)節(jié)性增生1例。

1.2 儀器設(shè)備 PCR熱循環(huán)儀（GeneAmp?PCR System 9600）及Gene Genius Match（syngene）全自動凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 主要試劑 RNA 提取試劑 Trizol（Invitrogen）、RT－PCR試劑、Oligo（dT，Promega）、M－mLV RT 5×buffer（Promega）、dNTP（Generay Biotech）、Rnase抑制劑（Promega）、M－mLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）、Master Mix（2×Taq PCR，Tiangen）、DNA ladder（Tiangen）等。

1.4 PCR引物 從http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov的 Gen－Bank中獲得人SUMO－1、β－actin基因序列，應用 Primer Primier5.0軟件設(shè)計引物，由Generay Biotech公司合成（表1）。

1.5 RT－PCR檢測SUMO－1mRNA表達 采用 Trizol提取肝癌及癌旁肝組織總RNA，合成cDNA。用PCR擴增每個標本中SUMO－1基因的表達，以β－actin作為內(nèi)參照。SUMO－1 PCR通過94℃預變性5min，然后94℃、35s，51℃、35s，72℃、35s30個循環(huán)，72℃延遲延伸7min。β－actin PCR通過94℃預變性5min，然后94℃、35s，54℃、35s，72℃、35s 30個循環(huán)，72℃延遲延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5μg／mL溴化乙錠），在紫外線燈下觀察結(jié)果，通過Gene Genius Match全自動凝膠成像分析系統(tǒng)測條帶灰度值。各標本SUMO－1mRNA表達量為SUMO－1密度值與各自β－actin灰度值的比值。

表1 PCR反應引物

2 結(jié) 果

2.1 SUMO－1mRNA在肝癌中明顯高表達，而在癌旁肝組織中表達較低（圖1～3）。12例肝癌標本中SUMO－1表達量為0.513±0.065，而癌旁肝組織中 SUMO－1表達量為0.05±0.03，兩組SUMO－1mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.009）。

圖1 AFP＞400ng／mL肝細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

圖2 AFP＜8ng／mL肝細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

圖3 肝膽管細胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1 mRNA表達水平

2.2 AFP＞400ng／mL肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mR－NA表達水平與AFP＜8.0ng／mL肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平相近（圖1、2），SUMO－1表達量分別為0.51±0.08、0.45±0.05，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.426）。

2.3 在肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標本中SUMO－1 mRNA 表達水平很低（圖4），SUMO－1表達量為 0.079±0.031，與肝癌標本比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.046）。

圖4 肝血管瘤、肝局灶性結(jié)節(jié)性增生及病灶旁肝組織中SUMO－1mRNA表達水平

3 討 論

SUMO是泛素樣蛋白家族中的一員，與泛素不同，SUMO與底物蛋白結(jié)合后不引起蛋白降解，而是調(diào)節(jié)蛋白功能［9］。越來越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)存在SUMO的修飾，這些蛋白的功能離不開SUMO的調(diào)節(jié)作用。SUMO家族蛋白在進化中高度保守，在脊椎動物中SUMO家族蛋白包括SUMO－1～4，SUMO－1廣泛參與人類癌癥相關(guān)蛋白功能的調(diào)節(jié)，促進癌癥的發(fā)生、發(fā)展［3－7］。因此SUMO－1與癌癥發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，是癌癥發(fā)生、發(fā)展的一個重要的調(diào)節(jié)因子。

肝癌是常見惡性肝腫瘤之一，由于起病隱匿、進展迅速，治療效果較差?，F(xiàn)今診斷肝癌的手段除臨床表現(xiàn)及體征外，影像學技術(shù)特別是CT、MRI的進步在肝癌診斷中發(fā)揮不可或缺的重要作用。AFP是部分肝細胞性肝癌分泌的蛋白質(zhì)，是診斷肝細胞性肝癌的一個重要的參考指標。我國頒布的肝細胞性肝癌的臨床診斷標準中，AFP具有重要的確診價值。AFP＞400ng／mL加上有肝癌特征的影像學檢查，即可確診為肝癌。AFP是我國診斷肝癌的重要參考指標，但不同的肝癌患者其血清AFP水平明顯不同，有些肝細胞性肝癌患者外周血AFP在正常值范圍，因此尋找一種廣泛存在于肝癌中能夠協(xié)助診斷肝癌的標志物具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，在mRNA及蛋白水平SUMO－1基因在肝癌標本中均明顯高表達，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達較低［8］。通過RNAi方法，抑制肝癌細胞株SMMC－7721中SUMO－1的表達，可明顯抑制 SMMC－7721的生長［10］，提示 SUMO－1與肝癌發(fā)展關(guān)系密切。本研究采用RT－PCR方法，檢測肝癌、癌旁肝組織及肝良性腫瘤中SUMO－1mRNA表達水平，并與臨床常用的肝細胞性肝癌標志物AFP對比研究SUMO－1 mRNA診斷肝癌的應用價值。結(jié)果顯示，在肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平明顯高于癌旁肝組織，也明顯高于肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標本。盡管在不同肝細胞性肝癌患者血清中存在AFP量的差異，但在不同肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA均明顯高表達，不同AFP水平患者肝細胞性肝癌標本中SUMO－1mRNA表達水平無明顯差異，因此鑒于在所有肝癌標本中均有SUMO－1mRNA高表達，SUMO－1 mRNA可成為診斷肝癌的一個有價值的指標。

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