臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展及其在耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

劉曉燕 王 紅

(公安縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 公安 434300)(湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展及其在耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

劉曉燕 王 紅

(公安縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 公安 434300)(湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

臨床檢驗(yàn)技術(shù)；耐藥基因；分子生物學(xué)技術(shù)

一份準(zhǔn)確全面的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)報(bào)告是醫(yī)生做出準(zhǔn)確診斷與制定正確治療方案必不可少的依據(jù)。因此，臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)是一門極其重要的醫(yī)學(xué)學(xué)科。筆者對(duì)臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r及新技術(shù)在細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用作簡(jiǎn)要綜述。

1 臨床檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展特點(diǎn)

20世紀(jì)40年代前，我國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)基本上為一片空白，大多數(shù)醫(yī)院未設(shè)立專業(yè)的檢驗(yàn)科室或只是開展極其簡(jiǎn)單的檢驗(yàn)項(xiàng)目。50年代才開始有醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)。1982年，我國(guó)正式成立衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，為國(guó)內(nèi)外臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制方法和質(zhì)量管理經(jīng)驗(yàn)交流建立了平臺(tái)，使國(guó)內(nèi)的臨床檢驗(yàn)走上了規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的道路。

近二十年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛滲透，最新的生物技術(shù)和生物信息研究成果不斷地進(jìn)入到臨床實(shí)驗(yàn)室?，F(xiàn)代臨床檢驗(yàn)技術(shù)主要有以下特點(diǎn)。

1.1檢驗(yàn)技術(shù)操作的自動(dòng)化程度日益提高現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)已經(jīng)從以前的手工操作和簡(jiǎn)單的生化測(cè)試方法，轉(zhuǎn)變成今天的全自動(dòng)化設(shè)備，能夠檢測(cè)多種生化、免疫等指標(biāo)，并能檢測(cè)疾病相關(guān)基因，成為一門涉及多領(lǐng)域的學(xué)科。在現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中，全自動(dòng)生化測(cè)試儀、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、自動(dòng)凝血儀、自動(dòng)免疫測(cè)試儀、質(zhì)譜儀等已經(jīng)成為不可缺少的組成部分?，F(xiàn)代化儀器的使用，加快了臨床檢驗(yàn)發(fā)展的速度，提高了準(zhǔn)確率和精確度，同時(shí)減輕了工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。

1.2免疫標(biāo)記技術(shù)、熒光技術(shù)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展80年代后期至90年代，免疫比濁測(cè)定、凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)發(fā)展到免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、酶免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、膠體金和膠體曬免疫技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、蛋白質(zhì)芯片、蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜和流式細(xì)胞技術(shù)紛紛應(yīng)用于臨床，大大提高了檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)范圍。

20世紀(jì)中期開始,分子生物學(xué)拉開序幕，從DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn),限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用,到DNA測(cè)序方法的成熟和PCR技術(shù)的誕生,分子生物學(xué)的發(fā)展使生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代[1]。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在耐藥基因檢測(cè)和定位中的應(yīng)用

2.1聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種快速在體外從某種來(lái)源的模板DNA中擴(kuò)增目標(biāo)DNA的通用方法，是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。可用該技術(shù)對(duì)細(xì)菌核酸內(nèi)已知的耐藥性基因進(jìn)行篩查和驗(yàn)證。利用商品試劑盒從細(xì)菌中抽提的基因組、質(zhì)粒，純度和濃度均很高，可作為穩(wěn)定的DNA模板，通過挑取菌落煮沸裂解直接得到細(xì)菌DNA模板，方便快捷，適合大批量地進(jìn)行耐藥基因篩查[2]。引物的特異性以及擴(kuò)增體系和條件對(duì)于PCR的特異性和敏感性非常重要，每次實(shí)驗(yàn)中均應(yīng)包含陽(yáng)性對(duì)照樣本和陰性對(duì)照樣本。

2.2核酸雜交核酸雜交(molecular hybridization)是分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究工具，利用的是單鏈核酸分子間能退火形成雙鏈分子(也就是雜交)的能力。能形成雙鏈分子的單鏈分子間必須有高度的堿基互補(bǔ)配對(duì)。通常是利用一段被標(biāo)記的核酸分子作為探針(probe)，在許多未經(jīng)標(biāo)記的核酸分子混合物中鑒別同源DNA或RNA分子。

通常將細(xì)菌菌落直接轉(zhuǎn)移到濾膜上雜交，探針可采用同位素、地高辛或者生物素標(biāo)記。核酸雜交還可以用于耐藥基因定位。將細(xì)菌抽提出的質(zhì)粒通過瓊脂凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜并用特異性耐藥基因探針進(jìn)行雜交，觀察質(zhì)粒在電泳圖上的位置是否存在雜交信號(hào)可以判斷該耐藥基因是否定位于質(zhì)粒[3]。

2.3酶切克隆PCR和核酸雜交只能對(duì)已知的耐藥基因進(jìn)行篩查和驗(yàn)證，如果需要尋找未知的耐藥基因，可以利用酶切克隆和抗生素篩選的方法。通常對(duì)于具有抗生素耐藥表型的細(xì)菌，首先挑選合適的片段連接入載體(如質(zhì)粒，噬菌體)，通過該耐藥表型抗生素篩選重組子可以獲得攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，最后對(duì)所獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，明確耐藥基因的具體信息[4]。實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)是所挑選的內(nèi)切酶必須有比較合適的切點(diǎn)，即酶切片段大小要適中，片段太長(zhǎng)不易連接入載體，而片段太短則不能包含完整的基因序列，導(dǎo)致缺乏耐藥表型[5]。

2.4全基因組測(cè)序隨著測(cè)序技術(shù)在近幾年的飛速發(fā)展，獲得一個(gè)物種的全基因組序列已經(jīng)不是非常困難的事情，特別是相對(duì)簡(jiǎn)單的細(xì)菌基因組。明確耐藥株的核酸全序列之后，可以在基因組的水平對(duì)基因分布、代謝途徑、調(diào)控通路有一個(gè)全局性認(rèn)識(shí)，特別是可以明確耐藥基因的進(jìn)化和傳播機(jī)制，深入了解目前廣泛存在的細(xì)菌泛耐藥問題。比較傳統(tǒng)的方法是先構(gòu)建全組基因組DNA文庫(kù)，利用載體克隆大量的文庫(kù)DNA片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序，再將測(cè)序片段進(jìn)行拼接以獲得完整的基因組全長(zhǎng)[6]。

近兩年來(lái)，基于芯片技術(shù)的新的全基因組測(cè)序技術(shù)也已興起。Smith等[7]運(yùn)用此技術(shù)成功地完成了全長(zhǎng)3976746個(gè)堿基對(duì)的鮑曼不動(dòng)桿菌基因組測(cè)序工作。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用日益廣泛，將對(duì)揭示細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及流行的分子機(jī)制，控制耐藥細(xì)菌流行播散發(fā)揮日益強(qiáng)大的作用。

[1]許敏.美國(guó)臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)進(jìn)展的借鑒[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(2)：182-184.

[2] Cattoir V，Poirel L，Rotimi V，etal.Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterbacterial isolates[J]. J Antimicrob Chemother，2005，49：3091-3094.

[3] Poirel L，Van De Loo M，Mammeri H，etal.Association of beta-lactamase VEB-1[J]. AntimicrobAgents Chemother，2005，49：3091-3094.

[4] Hata M，suzuki M， Matsumoto M，etal.Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in shigella flexneri 2b[J]. Antimicrob Agents Chemother，2005，49：801-803.

[5] 俞去松. 分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(6)：610-613.

[6] Jin Q，Yuan Z，Xu J，etal.Genenome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichiacoli K12 and O157[J].Nucleic Acides Res，2002，30：4432-4441.

[7]Smith MG，Gianoulis TA，Pukatzki S，etal.New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis reveald by high-density pyrosequencing and transposo mutagenesis[J].Genes Dev，2007，21：601-614.

[編輯] 一 凡

R446.1

A

1673-1409(2010)02-R075-02

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.02.033

2010-02-28

劉曉燕(1975-)，女，湖北公安人，主管技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作。