衛(wèi)星搭載對白三葉光合特性的影響

王健,劉榮堂,張?zhí)N薇,曹靜娟

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所,北京 100094）

衛(wèi)星搭載的植物可產(chǎn)生形態(tài)學(xué)、物候期、細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子水平等一系列的變異[1]。植物材料在特殊的空間條件下,經(jīng)受強輻射、微重力、高真空等太空誘變因子的復(fù)合作用,發(fā)生遺傳性狀變異[2]。如小麥（Triticum aestivum）出現(xiàn)超綠突變體植株[3],黃瓜（Cucumis sativus）子葉有不同展開度的變異[4],草地早熟禾（Poa pratensis）平均葉片數(shù)增加[5],狗牙根（Cynodon dactylon）植株的節(jié)間長度變長[6]。除此以外,對空間搭載植物進一步的研究還發(fā)現(xiàn),龍牧803苜蓿（Medicago sativa）M2代的葉綠素含量明顯減少[7]。李社榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)空間搭載的玉米（Zea mays）后代葉片細(xì)胞壁薄厚凹凸不平,細(xì)胞大小不等,表面不規(guī)則,部分細(xì)胞退化消失,僅殘留細(xì)胞壁,細(xì)胞液泡化程度加劇,將細(xì)胞器擠至四周,并導(dǎo)致葉綠體變形等。本研究以草坪用白三葉（Tri folium repens）為對象,分析衛(wèi)星搭載對白三葉M1代葉綠素含量、光合特性以及細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響,旨為草坪草空間育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料供試材料為瑞文德白三葉。精選后的種子分為2份:一份作地面對照（CK）,另一份用于衛(wèi)星搭載（SP）。搭載的“實踐八號”育種衛(wèi)星,于2006年9月9日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心升空,衛(wèi)星在近地點187 km、遠(yuǎn)地點 463 km的近地軌道運行,于9月 24日返回地面。另一部分,貯存于地面溫濕度相近（20℃左右）的環(huán)境中。

2009年3月隨機選取部分種子,在溫室用育苗盤育苗,5月10日移栽到花盆中。

1.2 葉綠素的測定稱取剪碎處理的和對照白三葉新鮮葉片各0.2 g,轉(zhuǎn)入25 mL棕色容量瓶中,再加入80%的丙酮定容至刻度。將其放入暗室中浸提（浸提過程中搖動2～3次）24 h后,把葉綠體色素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內(nèi),以80%丙酮為空白對照,在721型分光光度計上分別以663、646 nm 波長進行比色,以原提取液為空白溶液,重復(fù)3次。按公式計算葉綠素a、b含量[9]。

式中,V表示浸提液總體積（mL）,W表示樣品質(zhì)量（g）。

1.3 光合特性測定2008年10月1日（晴天）采用便攜式光合作用分析儀（LI-6400,美國CID公司）在開路系統(tǒng)下測定各植株瞬時凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Cond）、蒸騰速率（Tr）以及胞間CO2濃度（Ci）。對照和處理各選擇5個植株,測定向陽面成熟葉片,分4個時間段:9:00-11:00,11:00-13:00,13:00-15:00,15:00-17:00。計算水分利用效率（WUE=Pn/Tr）[10]。

1.4 葉面積測定在測定光合特性之前,隨機選取處理和對照各5株,每一株隨機選取3個葉柄上的葉片,用掃描式活體葉面積儀（SHY-150,哈爾濱光學(xué)儀器廠）測定,并標(biāo)記測定的葉片。

1.5 超微結(jié)構(gòu)分別剪取處理和對照相同部位的葉片,切成1 mm2小塊,置于用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）配制的2.5%戊二醛溶液中進行前固定,用1%鋨酸后固定。經(jīng)0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗 30%、50%、70%、80%和90%丙酮系列脫水后,用環(huán)氧樹脂SPURR包埋、聚合。采用切片機（LKB-V,德國徠卡公司）超薄切片,染色,再用（JEM-1230,日本JEOL公司）透射電鏡,80 kV加速電壓下觀察并照相[11]。

1.6 數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)處理和對照圖形繪制采用Microsoft Excel軟件進行,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 衛(wèi)星搭載對白三葉葉片葉綠素的影響

衛(wèi)星搭載處理對葉綠素a、葉綠素總量有影響,表現(xiàn)出負(fù)向變異,即地面對照高于搭載組,衛(wèi)星搭載白三葉當(dāng)代植株葉片的葉綠素a和葉綠素總量顯著低于對照（P＜0.05）。而對于葉綠素b,衛(wèi)星搭載處理和對照二者間差異不顯著（P＞0.05）；衛(wèi)星搭載處理葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量的變異程度始終大于對照。

2.2 衛(wèi)星搭載對白三葉植株光合特性的影響在早上9:00-11:00,處理的胞間CO2濃度差異顯著低于對照（P＜0.05）,在13:00-15:00,凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均顯著低于對照（P＜0.05）。水分利用率（WUE）對照與搭載組間在各個時間段水平均差異不顯著（P＞0.05）（圖1-5）。

圖1 衛(wèi)星搭載對白三葉凈光合速率日變化的影響

圖2 衛(wèi)星搭載對白三葉氣孔導(dǎo)度日變化的影響

圖3 衛(wèi)星搭載對白三葉蒸騰速率日變化的影響

圖4 衛(wèi)星搭載對白三葉胞間CO2濃度日變化的影響

圖5 衛(wèi)星搭載對水分利用率日變化的影響

處理和對照的凈光合速率在9:00-11:00最高,而后一直呈下降趨勢。但在11:00-13:00、13:00-15:00,下降趨勢出現(xiàn)延緩現(xiàn)象。而處理和對照的氣孔導(dǎo)度在9:00-11:00最大,對照的蒸騰速率在13:00-15:00最大,在11:00-13:00氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率同步下降,但 13:00-15:00,氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率又略微上升。處理和對照的胞間CO2濃度在9:00-11:00最低,而后迅速上升,在13:00-15:00間達到最高。處理和對照的水分利用率與胞間 CO2濃度相反,在9:00-11:00最高,然后也是迅速下降,到下午13:00-15:00下降到最低點,然后開始上升。從圖1-3可以明顯看到,在1天中的4個時間段,凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率,處理均比對照低。

2.3 衛(wèi)星搭載對白三葉植株的超微結(jié)構(gòu)的影響對照與搭載組的白三葉葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)差異比較明顯,對照白三葉的細(xì)胞壁比較均勻,葉綠體也比較均勻的分布在整個細(xì)胞中（圖6a）,淀粉顆粒大,而且比較飽滿,較均勻的分布在各個葉綠體中,數(shù)量比較少（圖6c）。線粒體比較完整（圖6e）?；Ｆ瑢优帕姓R,且貫穿整個葉綠體（圖6g）。嗜鋨顆粒比較少,且大多數(shù)集結(jié)在葉綠體中央（圖6i）。

衛(wèi)星搭載組白三葉葉片的細(xì)胞,有的細(xì)胞壁呈不規(guī)則的增厚,扭曲,葉綠體大小不等,有的向細(xì)胞中央集中,葉綠體膜有的被撕裂（圖6b）。淀粉粒多,且大小不一,有的無序堆積在整個葉綠體中（圖6d）。線粒體相對完整,但有的線粒體有明顯的破裂,內(nèi)含物流出,出現(xiàn)空洞、溢裂的現(xiàn)象（圖6f）?；Ｆ瑢拥膶訑?shù)減少,直徑卻很大（圖6h）。推測與葉綠體的性狀扭曲有關(guān)。嗜鋨顆粒在葉綠體中有很大的不同,有的嗜鋨顆粒只分布在葉綠體的兩側(cè),且數(shù)量極少（圖6j）,而大多數(shù)葉綠體中的嗜鋨顆粒比較多,而且比較平均的分布在整個葉綠體中（圖6k）。

3 討論與結(jié)論

3.1 衛(wèi)星搭載對白三葉葉綠素的影響航天誘變能對白三葉光合特性及葉綠素的含量產(chǎn)生影響。有研究[12]發(fā)現(xiàn),草地早熟禾經(jīng)空間誘變后,3個變異株系葉片光合特性及葉綠素的含量及葉綠素a/b均發(fā)生改變,從而影響其對光能的利用效率、固定CO2的能力和對不同光質(zhì)的利用效率?？臻g條件引起葉綠素的損傷,或者負(fù)向變異較多。主要原因可能是處理引起葉綠素相關(guān)酶受到抑制,以及中間產(chǎn)物合成的減少；或者處理引起葉綠素酶作用增強,導(dǎo)致葉綠素的分解加快[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),處理葉綠素總量相對于對照顯著下降,其中主要是葉綠素a下降顯著。處理葉綠素b相對于對照含量下降,但差異不顯著。葉綠素a產(chǎn)生的熒光遠(yuǎn)大于葉綠素b,而這與光能的吸收,轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān)[15]。因此,處理一定程度影響了白三葉的光合作用。

圖6 衛(wèi)星搭載對白三葉植株的超微結(jié)構(gòu)的影響

3.2 衛(wèi)星搭載對白三葉光合特性的影響航天誘變能對白三葉光合特性及葉綠素的含量產(chǎn)生影響。假儉草（Eremochloa ophiuroides）和細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia japonica）的光合日變化曲線呈雙峰型,有“午休”發(fā)生[16]。而 Hodges[17]通過研究也發(fā)現(xiàn),由于中午日光輻射強烈,環(huán)境相對濕度和CO2含量降低,導(dǎo)致植物光合作用受抑制,凈光合速率的日變化曲線會有一個明顯的光合午休現(xiàn)象；韓建秋[18]研究發(fā)現(xiàn),土壤相對含水量為25%時,白三葉凈光合速率和蒸騰速率下降明顯,日變化曲線表現(xiàn)為單峰特征,氣孔導(dǎo)度顯著降低,而胞間CO2濃度升高,非氣孔限制成為Pn下降的主要原因。這與韓烈保等[19]的研究結(jié)果一致。本研究中,13:00-15:00,處理的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率顯著低于對照,處理和對照的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率都不呈明顯的雙峰型,凈光合速率處理和對照則一直都呈單峰下降的趨勢。這可能是由于在溫室中培養(yǎng),溫室的溫度過高,引起白三葉土壤水分蒸發(fā)過快,從而引起了“干旱脅迫”,造成凈光合速率下降。許大全[20]認(rèn)為,引起葉片光合速率降低的植物自身因素?zé)o外乎氣孔關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合活性的下降兩類,前者使胞間CO2濃度降低,后者使胞間CO2濃度增高。當(dāng)2種因素同時存在時,胞間CO2濃度變化的方向依賴于占優(yōu)勢的那個因素。也就是說,當(dāng)氣孔的部分關(guān)閉是葉片光合速率降低的主要原因時,胞間CO2濃度降低；而當(dāng)葉肉細(xì)胞光合活性降低是葉片光合速率降低的主要原因時,胞間CO2濃度增高。因此,考慮到上述可能的復(fù)雜情況,判斷哪一個因素占優(yōu)勢,標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)是胞間CO2濃度變化的方向。本研究發(fā)現(xiàn),處理和對照凈光合速率一直在下降,而處理和對照的胞間CO2濃度則不斷上升,說明處理和對照的葉肉細(xì)胞光合活性下降,而葉肉細(xì)胞光合活性的下降促使凈光合速率的下降。在整體上,處理比對照的下降明顯,尤其在13:00-15:00,處理的凈光合速率顯著下降。這可能與處理白三葉的葉綠素a和葉綠素總量顯著下降有關(guān)。

3.3 衛(wèi)星搭載對白三葉超微結(jié)構(gòu)的影響空間誘變的紅豆草（Onobrychis viciaef olia）葉片的細(xì)胞壁不規(guī)則的加厚,細(xì)胞質(zhì)稀薄,液泡大,葉綠體變小,形狀多為不規(guī)則,葉綠體內(nèi)的淀粉顆粒細(xì)小,但數(shù)量明顯多于對照,匍匐型突變體表現(xiàn)尤為明顯[21]。衛(wèi)星搭載后苜蓿細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的變化,搭載組細(xì)胞葉綠體扭曲,向細(xì)胞中央集中,膜膨散,基粒數(shù)目增多,基粒直徑增加,片層數(shù)減少,葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒數(shù)目增加,體積變大,線粒體內(nèi)外膜膨大或破裂,內(nèi)含物流出,嵴消失,出現(xiàn)空洞、溢裂現(xiàn)象,葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)量增多,體積變大,海綿細(xì)胞細(xì)胞壁明顯加厚；個別海綿細(xì)胞,淀粉粒幾乎占據(jù)了整個細(xì)胞,數(shù)目多,體積大[22]。本研究中,細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器大多為負(fù)向變異,或遭受一定程度的損傷。姚允聰?shù)萚23]發(fā)現(xiàn)弱光條件下桃（Prunus persica）葉片葉綠體的基粒數(shù)與基粒片層數(shù)的增加,可能使附著在基粒片層上的補光色素和光合酶增多,有利于光能在類囊體上的傳播。但是本研究發(fā)現(xiàn)光合效率下降,原因很可能是衛(wèi)星搭載白三葉葉片細(xì)胞中的葉綠體粒片層減少,從而使得嗜鋨顆粒在葉綠體中分布不集中,這可能造成了補光色素和光合酶的減少,從而不利于光能的傳遞。

[1]胡化廣,劉建秀,郭海林.我國植物空間誘變育種及其在草類植物育種中的應(yīng)用[J].草業(yè)學(xué)報,2006,15（1）:15-21.

[2]陳積山,張月學(xué),唐鳳蘭.我國草類植物空間誘變育種研究[J].草業(yè)科學(xué),2009,26（9）:173-177.

[3]虞秋成,黃寶才,嚴(yán)建民.作物空間誘變育種的現(xiàn)狀及展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2001（4）:4-6.

[4]李社榮,曾孟淺,劉雅楠,等.植物空間誘變研究進展[J].核農(nóng)學(xué)報,1998,12（6）:375-379.

[5]韓曹,孫振元,錢永強,等.神州三號飛船對草地早熟禾生物學(xué)特性的影響[J].草業(yè)科學(xué),2004,21（4）:17-19.

[6]王文恩,包滿珠,張俊衛(wèi),等.狗牙根輻射誘變后代變異植株的形態(tài)特征比較和ISSR分析[J].草業(yè)科學(xué),2009,26（12）:139-145.

[7]尚晨,韓貴清,陳積山,等.高能混合粒子場處理種子對龍牧 803苜蓿 M2代的抗寒性影響[J].草業(yè)學(xué)報,2009,18（6）:164-168.

[8]李社榮,劉雅楠,劉敏,等.玉米空間誘變效應(yīng)及其應(yīng)用的研究Ⅰ.空間條件對玉米葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報,1998,12（5）:19-25.

[9]朱建玲,徐志防,曹洪麟,等.Cd對南美蟛蜞菊光合特性的影響[J].生態(tài)環(huán)境,2008,17（2）:657-660.

[10]黃頂,張英俊,韓建國,等.白三葉、多年生黑麥草和鴨茅光合生理生態(tài)特性研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,11（2）:44-48.

[11]任麗花,黃敏敏,江枝和,等.干旱脅迫對圓葉決明葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國草地學(xué)報,2008,30（1）:30-34.

[12]韓曹,孫振元,巨關(guān)升,等.空間環(huán)境對草地早熟禾誘變效應(yīng)研究Ⅱ——光合特性和葉綠素含量[J].核農(nóng)學(xué)報,2005,19（6）:413-416.

[13]Romero-Puertas M C,Rodrigues-Serrano M,Corpas F J,et al.Cadmium-induced subcellular accumulation of O2·-and H2O2in pea leaves[J].Plant Cell and Environment,2004,27（9）:1122-1134.

[14]Lin R Z,Wang X R,Luo Y,et al.Effects of soil cadmium on growth,oxidative stress and antioxidant system in wheat seedlings（Triticum aestivumL.）[J].Chemosphere,2007,69（1）:89-98.

[15]孫建云,沈振國.鎘脅迫對不同甘藍(lán)基因型光合特性和養(yǎng)分吸收的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2007,18（11）:2605-2610.

[16]丁小球,胡玉佳,王榕楷.三種草坪草凈光合速率和蒸騰速率的日變化特點研究[J].草業(yè)科學(xué),2001,18（4）:62-68.

[17]Hodges J D.Pattern of photosynthesis under natural environmental conditions[J].Ecology,1967,48:234-242.

[18]韓建秋.水分脅迫對白三葉光合特性的影響[J].上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2009,2（9）:106-109.

[19]韓烈保,胡九林,楊永利,等.白三葉草坪蒸散和光合蒸騰速率日變化研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,28:22-25.

[20]許大全.光合作用氣孔限制分析中的一些問題[J].植物生理學(xué)通訊.1997,33（4）:241-244.

[21]張?zhí)N薇,任衛(wèi)波,劉敏,等.紅豆草空間誘變突變體葉片同工酶及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析[J].草業(yè)學(xué)報,2004,12（3）:223-226.

[22]馮鵬,李鍵,張?zhí)N薇,等.不同含水量紫花苜蓿種子空載后當(dāng)代葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)研究[J].核農(nóng)學(xué)報,2009,23（4）:561-565.

[23]姚允聰,王紹輝,孔云.弱光條件下桃葉片結(jié)構(gòu)及光合特性與葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40（4）:855-863.