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    超臨界CO2殺菌過(guò)程中萃取機(jī)制研究

    2010-03-23 03:34:10周先漢程麗梅曾慶梅宋俊驊周典飛
    食品科學(xué) 2010年17期
    關(guān)鍵詞:萃取液層析濾紙

    周先漢,程麗梅,曾慶梅,張 安,宋俊驊,周典飛

    (1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    超臨界CO2殺菌過(guò)程中萃取機(jī)制研究

    周先漢1,2,程麗梅2,曾慶梅1,張 安2,宋俊驊2,周典飛2

    (1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    在相同工藝條件下對(duì)大腸桿菌菌懸液作超臨界CO2處理,對(duì)不同時(shí)間段萃取液的成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明,萃取物主要有兩大類(lèi):非極性脂肪酸類(lèi)及極性較弱的小分子氨基酸類(lèi)物質(zhì),均為細(xì)胞的功能性物質(zhì)。證實(shí)在超臨界CO2殺菌過(guò)程中確實(shí)發(fā)生了萃取作用。

    超臨界CO2;萃取;殺菌機(jī)理;大腸桿菌

    與熱殺菌、化學(xué)藥物殺菌等傳統(tǒng)殺菌技術(shù)相比,超臨界CO2殺菌很少導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失及產(chǎn)生煮熟味,較好解決了殺菌過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)多損失及色香味嚴(yán)重劣化等問(wèn)題;與超高壓等新興的殺菌技術(shù)相比,具有成本低、節(jié)約能源、節(jié)省空間、連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

    超臨界CO2殺菌技術(shù)由Fraser于1951年發(fā)現(xiàn)[1],限于當(dāng)時(shí)的條件,殺菌效果難以達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用要求。1980年日本學(xué)者Kamihira等[2]用CO2對(duì)具有熱敏性特征的生物制品、化合物、食品進(jìn)行了殺菌實(shí)驗(yàn),效果良好。國(guó)內(nèi)直到20世紀(jì)90年代末才見(jiàn)文獻(xiàn)提及并推薦將超臨界CO2流體技術(shù)用于衛(wèi)生、食品殺菌。超臨界CO2使細(xì)胞致死的機(jī)理相對(duì)比較復(fù)雜,至今還沒(méi)見(jiàn)文獻(xiàn)作出較有說(shuō)服力的闡述,大多是在相關(guān)推測(cè)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的基礎(chǔ)上提出的一些假設(shè)。目前普遍認(rèn)為,其滅菌機(jī)理主要是以下幾種[3]:1)超臨界CO2處理能抽出微生物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜功能性物質(zhì),使微生物細(xì)胞受到損傷;2)由于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)CO2電離,使細(xì)胞質(zhì)氫離子濃度增大,pH值下降;3)微生物細(xì)胞內(nèi)某些酶由于浸透在CO2中而失活;4)溶解于微生物細(xì)胞內(nèi)的CO2急速減壓時(shí)體積膨脹而使細(xì)胞破裂。本實(shí)驗(yàn)主要研究超臨界CO2處理后萃取液的主要成分,通過(guò)對(duì)不同時(shí)間段萃取液中的脂肪酸和氨基酸標(biāo)志性成分的分析,追溯其來(lái)源,探討超臨界CO2殺菌過(guò)程中的萃取機(jī)制。由于軟脂酸、硬脂酸等長(zhǎng)鏈非極性脂肪酸是構(gòu)成細(xì)菌生物膜的重要組成部分,而生物膜的破壞將導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。丙氨酸、谷氨酸等極性較弱的小分子氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子,氨基酸的缺失將使蛋白質(zhì)合成受阻,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此確定這兩類(lèi)物質(zhì)為目標(biāo)物質(zhì),用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法確定目標(biāo)脂肪酸的種類(lèi),用紙色譜法確定目標(biāo)氨基酸的種類(lèi)。

    1 材料與方法

    1.1 微生物菌種

    大腸桿菌(Escherichia coli 20234)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

    1.2 材料與試劑

    所用培養(yǎng)基及溶液所需試劑均為分析純。

    CM0002#液體培養(yǎng)基由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供,配方為:蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%,pH7.0,121℃下滅菌20min(CM0002#固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%~2.0%的瓊脂)。冷卻后放置4℃下,備用。

    磷酸鹽緩沖液:Na2HPO40.1mol/L、NaH2PO40.1mol/L,pH7.0;紙色譜展開(kāi)劑:正丁醇、醋酸、水按體積比4:1:2的比例在分液漏斗中混合,振蕩后放置分層,棄去水層,取上層有機(jī)相,備用;紙色譜顯色劑:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%~0.25%茚三酮的水飽和正丁醇溶液。

    1.3 儀器與設(shè)備

    HA121-50-01-C超臨界CO2萃取裝置(萃取釜容積為1L,CO2由合肥恒泰電氣技術(shù)有限公司提供,純度99%)江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;SWO-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YXQ-SQ41.28蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;SHY-2A恒溫?fù)u床 江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;YY0027-90電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠; R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;50μL微量進(jìn)樣器 上海富眾儀器有限公司;QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司;定性層析濾紙。

    1.4 菌懸液的制備[4]

    取CM0002#液體培養(yǎng)基100mL,無(wú)菌環(huán)境中用接種環(huán)刮取一環(huán)培養(yǎng)好的E.coil菌種到CM0002#液體培養(yǎng)基中,30℃搖床中培養(yǎng)16h。培養(yǎng)好的菌液在高速冷凍離心機(jī)中以6000r/min離心10min,用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后倒入400mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中,此時(shí)菌懸液的濃度約為108CFU/mL,置于4℃冰箱中貯存。

    1.5 活細(xì)胞數(shù)的檢驗(yàn)

    采用平板菌落計(jì)數(shù)法。將超臨界CO2處理前后菌液稀釋至一定濃度后,涂布于CM0002#固體培養(yǎng)基平板上,35℃下培養(yǎng)16h后計(jì)數(shù)[5]。

    1.6 超臨界CO2處理

    為排除其他微生物和雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾,實(shí)驗(yàn)前用75%乙醇對(duì)設(shè)備進(jìn)行反復(fù)清洗,然后用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行清洗。清洗結(jié)束后在萃取釜和分離釜分別取樣,并涂布平板,計(jì)數(shù),確保設(shè)備無(wú)菌。取200mL按1.4節(jié)所述方法制備的菌懸液加入萃取釜中,預(yù)先設(shè)定萃取壓力20MPa,萃取溫度40℃[6-8]。待萃取釜、分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ均達(dá)到設(shè)定的溫度和壓力時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。分別收集30、60、90min萃取液,重復(fù)5次,同一時(shí)間段萃取液合并備用。

    圖1 高密度CO2滅菌設(shè)備工藝流程圖Fig.1 Schematic diagram for supercritical carbon dioxide sterilization

    1.7 萃取液成分分析

    超臨界CO2萃取液經(jīng)過(guò)正己烷分層萃取后分離得到正己烷層和水層,分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1mL后對(duì)兩部分混合物進(jìn)行分析。

    1.7.1 正己烷層成分GC-MS分析

    正己烷層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后向蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)剩余物加入5mL硫酸-甲醇,充分振蕩溶解,55℃恒溫水浴加熱10min后加入5mL正己烷充分萃取,合并萃取液,用飽和NaCl溶液洗滌兩次,靜置去上清液保存?zhèn)溆谩C分析[9-10]:色譜條件為CPSil88(100m×0.25mm,0.20μm);程序升溫:初溫70℃,保持10min,以5℃/min升溫至170℃,保持20min,再以2℃/min升溫至190℃,不保持,再以1℃/min升溫至210℃,保持20min;進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度分別為250℃和260℃;載氣為高純氦(He),流速0.84mL/min;進(jìn)樣量1.0μL,分流比為50:1;質(zhì)譜條件:電離方式為電子轟擊(EI),電子能量70eV,接口溫度260℃,電子倍增器電壓1.89kV,掃描范圍35~500u。

    1.7.2 水層成分分析[9,11]

    裁取30cm長(zhǎng)5cm寬的中速定性層析濾紙,使用微量進(jìn)樣器吸取50μL水層萃取液,在距離濾紙底端約5cm處加樣,一個(gè)樣品多次點(diǎn)樣,中間用電吹風(fēng)吹干。在密閉的展開(kāi)容器中展開(kāi),展開(kāi)劑滲透到離濾紙頂端約5cm處取出,自然干燥,噴顯色劑加熱顯色。計(jì)算Rf值。

    式中:R為各物質(zhì)斑點(diǎn)中心離開(kāi)原點(diǎn)的距離;R0為

    溶劑滲透前沿離開(kāi)原點(diǎn)的距離。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 正己烷層成分GC分析[12]

    對(duì)超臨界CO2處理30min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析[12-13],得到氣相色譜圖(圖2)。通過(guò)與長(zhǎng)鏈脂肪酸和相應(yīng)十九烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的對(duì)照,將所得質(zhì)譜圖與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照,確定其脂肪酸的種類(lèi)有:峰1為軟脂酸甲酯;峰2為硬脂酸甲酯;峰3為油酸甲酯;峰A為加入的內(nèi)標(biāo)物十九烷酸甲酯。

    圖2 超臨界CO2處理30min萃取液氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

    對(duì)超臨界CO2處理60min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析[14-15],得到的氣相色譜圖如圖3所示。同法確定其脂肪酸的種類(lèi)有:峰1為軟脂酸甲酯;峰2為硬脂酸甲酯;峰3為油酸甲酯;峰4為亞油酸甲酯。

    圖3 超臨界CO2處理60min萃取液氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

    對(duì)超臨界CO2處理90min后的萃取液進(jìn)行GC-MS分析,得到的氣相色譜圖如圖4所示。同法確定其脂肪酸的種類(lèi)有:峰1為軟脂酸甲酯;峰2為硬脂酸甲酯;峰3為油酸甲酯;峰4為亞油酸甲酯;峰5和峰7為亞麻酸甲酯峰(雙鍵位置不同,出峰時(shí)間不同);峰6為二十二碳六烯酸甲酯(二十二碳六烯酸DHA);峰8為花生四烯酸甲酯;峰9和峰10為桐油酸甲酯。

    通過(guò)3個(gè)時(shí)間段萃取液出峰時(shí)間的比對(duì)可以發(fā)現(xiàn):隨著超臨界萃取時(shí)間的增加,萃取液中被萃取物質(zhì)的種類(lèi)不斷增多,而且萃取液中含有硬脂酸、軟脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、桐油酸、花生四烯酸及DHA。這些物質(zhì)主要來(lái)自大腸桿菌細(xì)胞上的磷脂類(lèi)物質(zhì),在超臨界CO2處理下被萃取出來(lái)。

    圖4 超臨界CO2處理90min萃取液氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

    圖5 空白對(duì)照氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of blank control smaple

    空白對(duì)照組(不經(jīng)超臨界CO2處理的菌懸液)在以上各時(shí)間段均不出峰(圖5),而通過(guò)對(duì)不同時(shí)間段萃取物的GC-MS分析,可以發(fā)現(xiàn)在超臨界CO2處理過(guò)程中大腸桿菌細(xì)胞中的脂肪酸類(lèi)物質(zhì)被萃取出來(lái),而且對(duì)于不同時(shí)間段被萃取出物質(zhì)的種類(lèi)有所差別。

    2.2 水層萃取物紙層析

    層析濾紙上出現(xiàn)紫色斑點(diǎn),說(shuō)明萃取液中可能含有氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)物質(zhì),而雙縮脲反應(yīng)沒(méi)有紫色出現(xiàn),證實(shí)溶液中沒(méi)有蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)物質(zhì)的存在,因此可以斷定溶液中只存在氨基酸類(lèi)物質(zhì)[16-17]。不同時(shí)間段的超臨界萃取液紙層析結(jié)果如表1~3所示。

    表1 超臨界CO2處理30min萃取液紙層析Table 1 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 30 min

    表2 超臨界CO2處理60min萃取液紙層析Table 2 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 60 min

    分析紙層析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),3個(gè)不同時(shí)間段萃取液在層析濾紙上都出現(xiàn)了兩個(gè)較為明顯的斑點(diǎn),通過(guò)計(jì)算得到各點(diǎn)處的Rf。查表氨基酸的Rf值和最小檢知量,發(fā)現(xiàn)其中谷氨酸和甘氨酸的Rf值為0.32,丙氨酸的Rf值為0.39(谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品紙層析結(jié)果得到的Rf值與查表得到的結(jié)果相同),這3種氨基酸與計(jì)算得到的濾紙上氨基酸的Rf值較為接近。因此,濾紙上的氨基酸可能為這3種氨基酸中的兩種或3種。它們必然來(lái)自于大腸桿菌細(xì)胞,可能是細(xì)胞中游離的氨基酸,或者是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)組分水解而產(chǎn)生的氨基酸。

    3 結(jié) 論

    通過(guò)對(duì)超臨界CO2處理后不同時(shí)間段大腸桿菌萃取液中脂肪酸類(lèi)和氨基酸類(lèi)物質(zhì)成分的分析,可以判定:超臨界CO2殺菌過(guò)程中發(fā)生了萃取作用。長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)物質(zhì)及一部分極性較弱的小分子氨基酸被萃取出來(lái),并且隨著萃取時(shí)間的增加被萃取出的脂肪酸的種類(lèi)也隨之增加。

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    表3 超臨界CO2處理90min萃取液紙層析Table 3 Paper chromatographic results of Escherichia coli suspension after supercritical carbon dioxide sterilization for 90 min

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    Extraction Mechanism during the Sterilization of Supercritical Carbon Dioxide

    ZHOU Xian-han1,2,CHENG Li-mei2,ZENG Qing-mei1,ZHANG An2,SONG Jun-hua2,ZHOU Dian-fei2
    (1.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;2.School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

    Functional components in cytoplasm, cell membrane and cell wall can be dissolved by supercritical carbon dioxide. As a result, the cells will be damaged and die due to inactivation. The extraction mechanism during supercritical carbon dioxide sterilization was explored in this study. An Escherichia coli suspension at a concentration of 108CFU/mL was prepared and treated with supercritical carbon dioxide and composition analysis was performed on the extracts obtained at different time points. The results indicated that both non-polar fatty acids and polar weak small amino acids were the functional components in cells. This investigation demonstrates that extraction indeed occurs during supercritical carbon dioxide sterilization.

    supercritical carbon dioxide;extraction;sterilization mechanism;Escherichia coli

    TS201.3

    A

    1002-6630(2010)17-0014-04

    2009-11-05

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871739;30571304);安微省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(KJ2007A099)

    周先漢(1959—),男,副教授,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工、食品安全。E-mail:zhxhan@163.com

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