雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力

楊少輝，宋英今，王潔華，季 靜

(天津大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，天津 300072)

雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力

楊少輝，宋英今，王潔華，季 靜

(天津大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，天津 300072)

抗氧化能力是衡量果蔬營(yíng)養(yǎng)及保健價(jià)值的重要指標(biāo)之一。雪蓮果是一種藥食兩用植物，對(duì)多種慢性疾病有緩解作用。分別采用5種方法(DPPH、ABTS、FRAP、SASR和MCC)對(duì)雪蓮果塊根甲醇提取液的自由基清除能力及抗氧化活性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：DPPH法測(cè)定的Trolox當(dāng)量抗氧化能力(TEAC)為410.263mg Trolox/g md，抗壞血酸當(dāng)量抗氧化能力(AEAC)為230.485mg VC/g md，IC50值為1.464mg/mL；ABTS法測(cè)定的TEAC為267.584mg Trolox/g md，AEAC為41.597mg VC/g md，IC50值為1.269mg/mL；SRSA法測(cè)定的TEAC為652.816mg Trolox/g md，AEAC為101.451mg VC/g md，IC50值為7.720mg/mL。說(shuō)明雪蓮果塊根提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS+·和O2·三種不同的自由基均有一定的清除活性。此外，雪蓮果塊根提取物還具有較高的總抗氧化(FRAP值為131.723 mg FeSO4/g md)和較強(qiáng)的金屬螯合能力(73.193%)。

雪蓮果；塊根；抗氧化；自由基

近年來(lái)，食品學(xué)家及營(yíng)養(yǎng)學(xué)家一致認(rèn)為，我們?nèi)粘z入的果蔬有利于降低某些疾病發(fā)生的可能，包括癌癥及心腦血管疾病[1-2]。這些有益的作用被認(rèn)為來(lái)源于果蔬中的多種抗氧化物質(zhì)[3-5]，其中包括多酚、抗壞血酸、類胡蘿卜素以及生育酚等。它們能夠以抑制引發(fā)反應(yīng)和破壞鏈鎖反應(yīng)的方式清除自由基，還能以螯合金屬離子、消除過(guò)氧化氫以及清除超氧負(fù)離子和單態(tài)氧的方式抑制自由基的形成[6]。所以，抗氧化劑在預(yù)防上述疾病方面扮演著重要的角色，而果蔬正是人類攝取抗氧化物質(zhì)最主要的來(lái)源。

雪蓮果(SmaIlanthus sonchifolius，yacon)，菊科塊根作物，生熟皆可食用，是安第斯山脈高山地區(qū)印第安人的傳統(tǒng)食品，被認(rèn)為是可緩解糖尿病、腸道功能紊亂等多種慢性疾病的藥食兩用植物[7]。目前，在我國(guó)云南及其他部分地區(qū)已有大面積種植。隨著人們對(duì)功能性食品需求的日益增加，雪蓮果因其特殊的功能特性和良好的藥用價(jià)值越來(lái)越被重視。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)雪蓮果塊根抗氧化活性的研究很少，尤其是對(duì)各種自由基

清除能力的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)DPPH自由基清除能力測(cè)定法、ABTS+·清除能力測(cè)定法、鐵離子還原/總抗氧化能力測(cè)定(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)法、超氧陰離子自由基清除能力(superoxide radical scavenging activity，SRSA)法和金屬離子螯合能力(metal chelating capacity，MCC)法，共5種方法對(duì)雪蓮果的抗氧化活性及自由基清除能力進(jìn)行綜合分析，以期為雪蓮果保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮雪蓮果塊根購(gòu)于天津市水果批發(fā)市場(chǎng)(來(lái)源于昆明嵩明縣)，置于－72℃?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyltriazine，TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox，水溶性VE)、還原型輔酶I(nicotineamide adenine dinucleotide，NADH)、吩嗪硫酸甲醋(phenazine methosulphate，PMS)、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2-azino-bis-(3-ethylbmzothiazoline-sulfonic ac，ABTS)、抗壞血酸(VC) Sigma公司；所有藥品均為分析純。

UVProbe 2550紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；FD-1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 樣品制備

新鮮雪蓮果塊根液氮研磨后冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過(guò)70目篩，于4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｈ?.0g上述樣品(干質(zhì)量，md)用10mL 60%甲醇在50℃提取5h，提取液用濾紙過(guò)濾，對(duì)濾渣重復(fù)使用相同的條件再次提取，兩次的濾液合并，然后儲(chǔ)存在4℃以供分析。

1.3 DPPH法測(cè)定抗氧化能力[8-9]

不同質(zhì)量濃度(1、2.5、5g/100mL)的雪蓮果樣品液0.1mL分別加入2mL 6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液中，暗處30min，以甲醇溶劑做空白對(duì)照，測(cè)量其在波長(zhǎng)517nm處的吸光度(Ai)。測(cè)定2mL DPPH 甲醇溶液與0.1mL甲醇混合后在波長(zhǎng)517nm 處的吸光度(A0)；測(cè)定2mL甲醇溶液與0.1mL樣品液在波長(zhǎng)517nm 處的吸光度(Aj)。按(1)式計(jì)算自由基清除率。

另以不同濃度(0、250、500、1000、1500、2000 mmol/L)的Trolox和VC清除DPPH自由基的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算雪蓮果的Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)和AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)。

1.4 自由基陽(yáng)離子(ABTS+·)法測(cè)定抗氧化能力[10-11]

將等量的7mmol/L ABTS溶液與2.45mmol/L過(guò)硫酸鉀混合使之反應(yīng)并置于暗處12～16h以制備ABTS+·。用甲醇將ABTS+·溶液稀釋直至其在波長(zhǎng)734nm處吸光度為0.70 ± 0.02。將25μL不同質(zhì)量濃度(1、2.5、5g/100mL)樣品液加入2mL ABTS+·溶液中以稀釋，6min后測(cè)量其在波長(zhǎng)734nm處的吸光度(Ai)。測(cè)定2mL ABTS+·溶液與25 μL甲醇混合后在波長(zhǎng)517nm處的吸光度(A0)；測(cè)定2mL甲醇溶液與25 μL樣品液在波長(zhǎng)517nm處的吸光度(Aj)。按(2)式計(jì)算自由基清除率。

另以不同濃度(0、100、200、400、600、800、1000mmol/L)的Trolox和VC清除自由基的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算雪蓮果的Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.5 以超氧陰離子自由基清除能力法(SRSA)測(cè)定抗氧化能力[12]

50μL不同質(zhì)量濃度(1、2.5、5g/100mL)的樣品提取液中加入1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)以及150 μmol/L的NBT、60μmol/L的PMS和468μmol/L的NADH。置于25℃條件下8min，測(cè)量其在波長(zhǎng)560nm處的吸光度(Ai)。測(cè)定1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液與50μL甲醇混合后在波長(zhǎng)517nm 處的吸光度(A0)；測(cè)定1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液與50μL樣品液在波長(zhǎng)517nm處的吸光度(Aj)。按(3)式計(jì)算自由基清除率。

另以不同濃度(0、250、500、1000、1500、2000 mmol/L)的Trolox和VC清除自由基的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算雪蓮果的Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.6 鐵離子還原／抗氧化能力測(cè)定(FRAP)[13]

取0.1mL 不同質(zhì)量濃度(0.5、0.75、1.0g/100mL)的樣品溶液，加入1.8mL TPTZ工作液(由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成)，25℃反應(yīng)8min，波長(zhǎng)593nm處測(cè)定吸光度。

另以不同濃度(0、100、200、400、800、1200、2000mmol/L)的FeSO4做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化活性(FRAP值)以每克干質(zhì)量達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示(mmol FeSO4/g md)。

1.7 以金屬螯合能力法(MCC)測(cè)定抗氧化能力[10,14]

將1mL的提取液加入2.8mL蒸餾水中，再與50μL的

2mmol/L的FeCl2· 4H2O和150 μL的5mmol/L Ferrozine，振蕩混合。10min后，在波長(zhǎng)562nm處測(cè)量亞鐵離子-Ferrozine聯(lián)合體的生成量以確定Fe2+的量。同時(shí)以0.1mg/mL EDTA做對(duì)照。金屬螯合活性按(4)式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮果塊根提取液清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是穩(wěn)定的紫色自由基，在517nm處有最大吸收波長(zhǎng)。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基的單電子由于被配對(duì)，DPPH自由基濃度減小而使其顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值變小，且顏色變化與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系。由于這種方法簡(jiǎn)便、靈敏可靠，所以在國(guó)內(nèi)外廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選。為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)樣品間的抗氧化活性，常用清除率50%自由基時(shí)的溶液質(zhì)量濃度IC50來(lái)比較，較低的IC50值表示較高的自由基清除能力。

表1 雪蓮果塊根的DPPH自由基清除能力(x±s)Table 1 DPPH radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

雪蓮果塊根提取液的DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如表1所示，并以常用的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸作為對(duì)照。從表1可以看出，每克干質(zhì)量的雪蓮果塊根相當(dāng)于410.263mg Trolox (1.639mmol Trolox)，相當(dāng)于230.485mg VC (1.306mmol VC)，IC50為1.464mg/mL，這組數(shù)據(jù)雖然低于人工合成的常用抗氧化劑Trolox和VC，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.2 雪蓮果塊根提取液清除ABTS+·的能力

ABTS+·為一穩(wěn)定的有機(jī)自由基，試樣抗氧化能力越強(qiáng)，其提供電子的能力也就越強(qiáng)，與該有機(jī)自由基反應(yīng)量越大，反應(yīng)速率也越快，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，直接反應(yīng)出樣品抗氧化能力的大小。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了雪蓮果塊根提取液、Trolox和VC對(duì)ABTS+·的清除率(表2)，結(jié)果表明，與兩種常用人工抗氧化劑相比，雪蓮果塊根提取液的TEAC、AEAC和IC50雖然較低，分別為267.584mg Trolox/g md、41.597mg VC/g md和1.269mg/mL，但對(duì)ABTS+·仍有一定的清除作用。

表2 雪蓮果塊根的ABTS+·清除能力(x±s)Table 2 ABTS+· radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

2.3 雪蓮果塊根提取液清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子自由基(O2·)是生物體內(nèi)所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可以經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變。利用PMS及NADH作用產(chǎn)生超氧陰離子，而超氧陰離子會(huì)進(jìn)一步將NBT還原成diformazan，此化合物在波長(zhǎng)560nm處具有強(qiáng)吸光度，藉此吸光度值可以判定樣品清除超氧陰離子的能力。利用此方法測(cè)定雪蓮果塊根甲醇提取物對(duì)超氧陰離子清除能力(表3)，結(jié)果表明，雪蓮果塊根提取物的TEAC值為652.816mg Trolox/g (2.608mmol Trolox/g)、AEAC值為101.451mg VC/g (0.576mmol VC/g)、IC50為7.720mg/mL，對(duì)O2·的清除能力雖然低于人工抗氧化劑Trolox和VC，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

表3 雪蓮果塊根的O2·清除能力(x±s)Table 3 Superoxide anion radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

2.4 雪蓮果塊根提取液的FRAP抗氧化能力

抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與TPTZ結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)593nm處有最大光吸收。吸光度越大，表明抗氧化劑有越強(qiáng)的還原能力，因而具有越高的抗氧化活性。由于FRAP法不是針對(duì)某一種自由基清除能力，而是樣品總的還原能力，因此可用來(lái)反映樣品總的抗氧化活性[15]。

表4 雪蓮果塊根鐵離子還原／抗氧化能力及金屬螯合能力測(cè)定Table 4 FRAP and ferrous ions chelating capacity of yacon tubers

從表4可以看出，每克干質(zhì)量的雪蓮果塊根相當(dāng)于131.723mg FeSO4(0.867mmol FeSO4)，即雪蓮果塊根提取液將13.17%的Fe3+還原為了Fe2+，說(shuō)明雪蓮果塊根提取液具有較高的總抗氧化能力。

2.5 雪蓮果塊根提取液的金屬螯合能力

金屬離子(如鐵、銅)在自由基氧化過(guò)程中起催化劑作用，金屬離子螯合可以大大的降低金屬離子的催化作用，避免自由基生成。因此，對(duì)金屬螯合力大小的測(cè)定也是評(píng)價(jià)樣品抗氧化性能常用的方法。Ferrozine能夠與Fe2+形成紫紅色的螯合物，當(dāng)其他有競(jìng)爭(zhēng)力的螯合劑存在時(shí)，紫紅色會(huì)變淺。因此，通過(guò)螯合物顏色的變化，可以評(píng)價(jià)物質(zhì)對(duì)Fe2+的螯合能力。表4所示的結(jié)果表明，EDTA表現(xiàn)出極強(qiáng)的金屬螯合活性，在質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時(shí)就已達(dá)到94.31%的螯合率，雪蓮果塊根提取液也具有很強(qiáng)的螯合作用，0.1g/mL雪蓮果塊根提取液對(duì)Fe2+的螯合率為73.193%，相當(dāng)于EDTA的77.61%，說(shuō)明雪蓮果塊根的抗氧化能力很大程度上來(lái)自于它的金屬螯合能力。

3 討 論

DPPH、ABTS和SRSA這3種方法都是基于分光光度法，通過(guò)測(cè)定樣品清除自由基的能力而表征抗氧化能力，然而這3種方法的反應(yīng)機(jī)制和反應(yīng)條件不同。FRAP方法反映樣品還原Fe3+的能力，MCC法則測(cè)定樣品螯合Fe2+的能力。因此在測(cè)定樣品的抗氧化活性時(shí)，可以根據(jù)需要采用多種方法來(lái)綜合評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性及自由基的清除能力。

植物的抗氧化能力與其多酚類、黃酮類、VC、VE和類胡蘿卜素等物質(zhì)含量有一定的相關(guān)性[3]。很多資料表明，提取溶劑會(huì)顯著影響植物提取物中抗氧化成分的產(chǎn)量和抗氧化能力。植物可溶性酚類物質(zhì)主要分布在液泡中，而類黃酮類和不溶性多酚類物質(zhì)主要沉積在細(xì)胞壁上并與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵、疏水鍵相結(jié)合。水及低濃度甲醇、乙醇可以自由進(jìn)出細(xì)胞，高濃度甲醇、乙醇可能會(huì)引起組織中蛋白質(zhì)的變性，從而影響提取率。甲醇和乙醇相比，有較高的極性，且甲醇較低的分子質(zhì)量更易進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用60%甲醇作為提取溶劑，以期提取到更多的抗氧化物質(zhì)。但鑒于工業(yè)生產(chǎn)中大量使用甲醇的有害性，筆者正在進(jìn)一步探討用乙醇作為提取溶劑的最佳提取工藝。

考察了雪蓮果塊根甲醇提取液的體外抗氧化能力，在清除DPPH自由基能力、清除ABTS+·、對(duì)O2·的清除能力、鐵離子還原／抗氧化能力測(cè)定，以及對(duì)金屬離子的螯合能力測(cè)定中均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。但其抗氧化成分未知，有待進(jìn)一步以柱層析分離法、高效液相制備色譜法(HPLC)及超臨界CO2萃取等方法進(jìn)行分離純化，再以紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振分析對(duì)活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[17]。有研究表明雪蓮果葉片中富含硒和多糖、酚酸、黃酮類等功能性成分[18-19]，雪蓮果塊根中抗氧化功能成分的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室有關(guān)此方面的工作正在進(jìn)一步展開(kāi)。

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in vitro Antioxidant and Free Radical Scavenging Activities of Yacon (Smallanthus sonchifolius) Tubers

YANG Shao-hui，SONG Ying-jin，WANG Jie-hua，JI Jing
(School of Agriculture and Bioengineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Antioxidant capacity is an important factor indicating nutritional and health value of fruits and vegetables. Yacon is a both edible and medicinal plant, which has some preventing roles for a number of chronic diseases. In this study, to assess the in vitro antioxidant potential of yacon tubers, the 60% methanol extract from yacon tubers was tested for its scavenging capacities against DPPH, ABTS+·, superoxide anion radicals, ferric reducing antioxidant power and ferrous ions chelating capacity. The DPPH radical scavenging assay of the extract showed a trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of 410.263 mg Trolox /g md, a ascorbic acid equivalent antioxidant capacity (AEAC) of 230.485 mg VC/g mdand a median inhibition concentration (IC50) of 1.464 mg/mL, and the ABTS+· radical scavenging assay showed a TEAC of 267.584 mg Trolox/g md, an AEAC of 41.597 mg VC/g md and an IC50 of 1.269 mg/mL, and the TEAC, AEAC and IC50 obtained in the superoxide anion radical assay were 652.816 mg Trolox/g md, 101.451 mg VC/g mdand 7.720 mg/mL, respectively. These results demonstrate that the extract from yacon tubers has scavenging effect against all DPPH, ABTS+·, superoxide anion radicals. Moreover, the extract also presented high ferric reducing antioxidant power (131.723 mg FeSO4/g md) and strong ferrous ions chelating capacity (73.193%).

yacon；tuber；antioxidant activity；radical

TS255.2

A

1002-6630(2010)17-0166-04

2010-06-30

教育部新教師基金資助項(xiàng)目(20090032120071)

楊少輝(1977—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。E-mail：shaohuiyang77@tju.edu.cn