微生物源類胡蘿卜素研究進(jìn)展

趙 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

微生物源類胡蘿卜素研究進(jìn)展

趙 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

類胡蘿卜素對(duì)人類身體健康的重要性日益受到人們關(guān)注，越來(lái)越多的類胡蘿卜素功能食品走進(jìn)市場(chǎng)。為滿足人們對(duì)類胡蘿卜素日益增長(zhǎng)的需要，成本低、純度高、更加安全的微生物源類胡蘿卜素產(chǎn)品有逐漸替代化學(xué)合成和植物提取產(chǎn)品的趨勢(shì)。本文對(duì)類胡蘿卜素在微生物中的分布、資源、生產(chǎn)技術(shù)和市場(chǎng)潛力進(jìn)行綜述，為更有效地利用微生物中的類胡蘿卜素資源，研發(fā)相應(yīng)的生產(chǎn)技術(shù)，向市場(chǎng)提供更安全、質(zhì)量更好的類胡蘿卜素產(chǎn)品提供參考。

類胡蘿卜素；微生物；微藻；轉(zhuǎn)基因

大量的動(dòng)物和人體血液及組織分析結(jié)果表明，人體內(nèi)含有豐富的類胡蘿卜素(carotenoid)。這些化合物與人體健康和降低疾病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，例如控制前列腺疾病和退行性黃斑衰退癥等疾病[1-2]。因此，人類需要通過(guò)食物來(lái)補(bǔ)充類胡蘿卜素，以保證健康。但所有動(dòng)物都不能自身合成類胡蘿卜素，人類體內(nèi)也不能合成類胡蘿卜素，只能通過(guò)攝食含有類胡蘿卜素的植物及低等生物或生物富集而獲得類胡蘿卜素。微生物作為地球上出現(xiàn)最早的生物，在類胡蘿卜素富集的整個(gè)生物鏈中起著重要的作用。

幾十年來(lái)，類胡蘿卜素在商業(yè)上的生產(chǎn)，通常是利用化學(xué)合成法或從高等植物中提取，例如從番茄和紅辣椒中提取的番茄紅素(l y c o p e n e)和辣椒紅素(capsanthin)。在自然界中，有些單細(xì)胞綠藻在一定條件下，由于高濃度次生代謝產(chǎn)物——類胡蘿卜素的積累會(huì)變紅。例如，杜氏藻(Dunaliella salina)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中存在著豐富的β-胡蘿卜素(β-carotene)和蝦青素(astaxanthin)(圖1)。

圖1 β-胡蘿卜素(a)和蝦青素(b)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structures ofβ-carotene (a) and axtaxanthin (b)

大量的類胡蘿卜素能夠在細(xì)菌(bacteria)、酵母

(yeast)和霉菌(mould)等微生物中積累，所以這些微生物有很大的商業(yè)應(yīng)用前景。在食品產(chǎn)業(yè)中，利用發(fā)酵獲得的原料成分逐年增加。例如：增稠或膠凝劑(黃原膠、凝膠多糖、凝膠糖等)、香味劑(酵母水解物、谷氨酸鈉等)、風(fēng)味化合物(γ-癸內(nèi)酯、丁二酮、甲酮等)和酸化劑(乳酸、檸檬酸等)等的生產(chǎn)[3]。發(fā)酵技術(shù)也已經(jīng)大規(guī)模地用于著色劑的生產(chǎn)。目前有些產(chǎn)品已在食品產(chǎn)業(yè)中大量應(yīng)用。例如：在歐洲，利用三孢布拉霉(Blakeslea trispora)生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素；在亞洲，利用紅曲霉(Monascus purpureus Went)生產(chǎn)開(kāi)環(huán)類胡蘿卜素[4-5]。應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)食品著色劑降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，與合成色素或植物提取物相比，發(fā)酵產(chǎn)品具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。如果能發(fā)現(xiàn)或篩選出新的微生物物種，可以進(jìn)一步降低類胡蘿卜素產(chǎn)品的成本。

微生物源的類胡蘿卜素產(chǎn)品已經(jīng)可以被用作食品或飼料色素添加劑，目前正在討論將其作為功能性食品使用的可能性[6]。本文對(duì)類胡蘿卜素在微生物中的分布、資源、生產(chǎn)技術(shù)和市場(chǎng)潛力進(jìn)行綜述，為更有效地利用微生物中的類胡蘿卜素資源，研發(fā)相應(yīng)的生產(chǎn)技術(shù)，向市場(chǎng)提供更安全、質(zhì)量更好的類胡蘿卜素產(chǎn)品提供參考。

1 利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素

在現(xiàn)代微生物概念的范疇內(nèi)，目前至少有從微藻(microalgae)、霉菌、酵母和細(xì)菌中生產(chǎn)類胡蘿卜素產(chǎn)品的工業(yè)化實(shí)踐的報(bào)道。尤其是從微生物中生產(chǎn)β-胡蘿卜素的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。從微生物中生產(chǎn)的其他類胡蘿卜素包括：番茄紅素、蝦青素、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)和角黃質(zhì)(canthaxanthin)。它們的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1～2。

圖2 番茄紅素(a)、玉米黃質(zhì)(b)和角黃質(zhì)(c)的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 The molecular structures of lycopene (a), zeaxanthin (b) and canthaxanthin (c)

1.1 β-胡蘿卜素

目前大規(guī)模生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法主要有化學(xué)合成法和植物資源(如紅棕櫚油)提取法[7]。近20年來(lái)，微生物發(fā)酵法也已初具規(guī)模。在這一領(lǐng)域，首先應(yīng)當(dāng)關(guān)注的是：不同的生產(chǎn)方法會(huì)造成產(chǎn)品質(zhì)量上的差異。這一差異主要集中在兩個(gè)方面：1)β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體組成上的差異；2)類胡蘿卜素組成上的差異，尤其是生物合成中間體組成上的差異。具體差異比較見(jiàn)表1[8]。

表1 不同來(lái)源β-胡蘿卜素產(chǎn)品的類胡蘿卜素組成Table 1 Composition ofβ-carotene products from different sources

1.1.1 杜氏藻

雖然藍(lán)藻屬中的螺旋藻能夠在體內(nèi)積累數(shù)量可觀的β-胡蘿卜素(0.8～1.0g/100g干基)，但在生產(chǎn)上多采用微藻中的杜氏藻(Dunaliella salina，又名鹽生杜氏藻)生產(chǎn)β-胡蘿卜素。

杜氏藻是一種耐鹽單細(xì)胞游動(dòng)的綠藻，屬于綠藻綱[9]。與高等植物相比具有簡(jiǎn)單快速地培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。在適宜的條件下，杜氏藻與其他β-胡蘿卜素源相比具有很高的含量(3～5g/100g干基)，產(chǎn)量亦可觀(400mg/m3)[10]。

杜氏藻細(xì)胞沒(méi)有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，具有杯狀葉綠體，與高等植物的葉綠體相似。其生長(zhǎng)在高鹽濃度環(huán)境中，需要碳酸氫鹽作為碳源。同時(shí)，還需要硝酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最初的光合生長(zhǎng)階段需要12～14d，需要在富含硝酸鹽的培養(yǎng)基中；隨后的類胡蘿卜素形成階段需要消耗硝酸鹽，因此必須維持其鹽度。杜氏藻最適合生長(zhǎng)在富含鹽和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的沿海區(qū)域。在類胡蘿卜素合成階段中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、鹽度或光的脅迫是必須滿足的條件。

在最初的光合生長(zhǎng)階段，杜氏藻需要5～10klx光照度。而在類胡蘿卜素積累階段，光照強(qiáng)度應(yīng)該在25～30klx的范圍內(nèi)。另外在高光強(qiáng)度下，杜氏藻會(huì)產(chǎn)生較大比例的順式異構(gòu)體，其中9-順式-β-胡蘿卜素可達(dá)50%[10]。據(jù)報(bào)道[11]，在一定的脅迫條件下(如高強(qiáng)度的光照)，杜氏藻能夠大量積累β-胡蘿卜素，同時(shí)又可生產(chǎn)豐富的蛋白質(zhì)和必需脂肪酸。另?yè)?jù)報(bào)道，杜氏藻具有多種健康功能，如抗高血壓、擴(kuò)張支氣管、止痛、松弛肌肉和抗水腫等。

FDA已經(jīng)認(rèn)可杜氏藻的藻體可以直接用作食物或飼料[11]。用食用油或者是食品安全級(jí)有機(jī)溶劑從杜氏藻中提取的β-胡蘿卜素可用在各種食品的配方中，例如用橄欖油和豆油提取的β-胡蘿卜素可用在藥物配方中。需要指出的是，在天然提取物中，通常會(huì)含有少量的其他類胡蘿卜素，因此在市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品多為混合物。

澳大利亞、中國(guó)、印度、以色列、日本和美國(guó)都是杜氏藻的主要生產(chǎn)地。此外，在其他幾個(gè)環(huán)境條件適宜的國(guó)家也有小規(guī)模的生產(chǎn)。目前，市場(chǎng)上存在很多不同種類的杜氏藻源β-胡蘿卜素產(chǎn)品。純化過(guò)的β-胡蘿卜素大部分以1～20g/100mL的含量分散在植物油中出售，可作為添加劑和著色劑應(yīng)用。同時(shí)，也可制成軟膠囊出售。一般每個(gè)膠囊含5mgβ-胡蘿卜素。

1.1.2 三孢布拉霉

三孢布拉霉是一種與熱帶植物共生的霉菌，分正株和負(fù)株兩種類型。正株合成三孢子酸，三孢子酸既是β-胡蘿卜素的代謝物，又是其生物合成的調(diào)節(jié)劑。以特定比例交配兩種類型的菌株，三孢子酸就能夠刺激負(fù)株合成大量的β-胡蘿卜素。

生產(chǎn)過(guò)程基本上分兩個(gè)階段：第一階段：以葡萄糖和玉米漿作為碳源和氮源進(jìn)行發(fā)酵。開(kāi)始時(shí)，進(jìn)行原始菌株培養(yǎng)，隨后用有氧深層發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生豐富的β-胡蘿卜素；第二階段：也稱恢復(fù)階段。在這一階段中，菌株被分離和轉(zhuǎn)化成適合提取β-胡蘿卜素的形式。被分離的?-胡蘿卜素可在乙酸乙酯中結(jié)晶達(dá)到適當(dāng)?shù)募兓蜐饪s目的。最后的產(chǎn)品是β-胡蘿卜素晶體或者是30g/100mL質(zhì)量濃度的植物油分散體系[12]。

從三孢布拉氏霉生產(chǎn)β-胡蘿卜素首次嘗試是在1995年。通過(guò)在小鼠上進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和對(duì)最終產(chǎn)品中4種真菌毒素的酶聯(lián)免疫法測(cè)定，以小鼠的致病性為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)證實(shí)三孢布拉霉沒(méi)有致病性和毒性[13]。通過(guò)HPLC分析、穩(wěn)定性檢測(cè)和微生物檢驗(yàn)證實(shí)了由三孢布拉霉發(fā)酵所得到的β-胡蘿卜素晶體符合歐盟專家委員會(huì)在95/45/EC法規(guī)中列出的反式和順式異構(gòu)體的比例，未檢出真菌毒素或其他有毒代謝物和遺傳毒性等。用所產(chǎn)的β-胡蘿卜素產(chǎn)品喂養(yǎng)大鼠28d后，未發(fā)現(xiàn)有害的癥狀。據(jù)此，歐盟委員會(huì)規(guī)定以日常飲食的5%為最高攝入劑量。歐盟科學(xué)委員會(huì)認(rèn)為由三孢布拉霉發(fā)酵所得到的β-胡蘿卜素與由化學(xué)合成品在做為食品著色劑時(shí)具有相當(dāng)?shù)淖饔?。因此，可以做為食品著色劑使用[14]。

目前，在俄羅斯、烏克蘭和西班牙均有由三孢布拉霉生產(chǎn)β-胡蘿卜素的工業(yè)生產(chǎn)。其產(chǎn)品的含量已經(jīng)達(dá)到30mg/g 平基或3g/L培養(yǎng)液[15]。

1.1.3 布拉克須霉

布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)也屬于真菌，也是β-胡蘿卜素的一種重要來(lái)源[16]。在適宜條件下，野生型菌株中β-胡蘿卜素的含量大約在0.05mg/g干基。有些突變株能夠積累到10mg/g干基[17]。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常使用發(fā)酵桶培養(yǎng)布拉克須霉[18]。

1.1.4 卷枝毛霉菌

野生型卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)由于積累β-胡蘿卜素而顯橙黃色。藍(lán)光的誘導(dǎo)是其體內(nèi)類胡蘿卜素生物合成的必需條件[19]。卷枝毛霉菌既可以單細(xì)胞又可以菌絲體的形式生長(zhǎng)，是二相性真菌?，F(xiàn)在研究的重點(diǎn)是利用生物技術(shù)獲得有用的酵母樣突變株[14]。

1.2 番茄紅素

番茄紅素可以通過(guò)化學(xué)法合成或從番茄中提取。發(fā)酵法大規(guī)模地生產(chǎn)番茄紅素的技術(shù)也已形成。不同的生產(chǎn)方法造成產(chǎn)品中幾何異構(gòu)體組成的差異見(jiàn)表2[20]。

表2 不同來(lái)源番茄紅素的幾何異構(gòu)體組成Table 2 The geometrical isomer composition of lycopene from different sources%

番茄紅素是β-胡蘿卜素等所有雙環(huán)類胡蘿卜素生物合成的前提。因此，可以通過(guò)在微生物體內(nèi)阻止環(huán)化反應(yīng)或抑制環(huán)化酶來(lái)積累番茄紅素。這種方法已經(jīng)在商業(yè)生產(chǎn)番茄紅素中應(yīng)用。

1.2.1 三孢布拉霉

目前商業(yè)中已經(jīng)建立了從三孢布拉霉生產(chǎn)番茄紅素的生產(chǎn)工藝。在液體培養(yǎng)液中加入咪唑或嘧啶可抑制番茄紅素環(huán)化酶[21]，使體內(nèi)積累番茄紅素。產(chǎn)品中主要是全反式番茄紅素?？稍诋a(chǎn)品中加入番茄紅素量1%VE。產(chǎn)品的形態(tài)一般為20%或5%的葵花油分散體系。番茄紅素油分散液可用作食品配料和食品強(qiáng)化劑。

根據(jù)歐洲議會(huì)和理事會(huì)關(guān)于新食品和新型食品添加劑使用的第258/97號(hào)法規(guī)，批準(zhǔn)可在食品中使用由三孢布拉霉生產(chǎn)的番茄紅素[22]。歐洲食品安全局評(píng)價(jià)本產(chǎn)品可作為食品色素使用。具體結(jié)論是：由三孢布拉霉生產(chǎn)的番茄紅素在營(yíng)養(yǎng)上相當(dāng)于天然番茄紅素，但還需要進(jìn)一步的安全性實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 擬枝孢鐮刀菌

目前，擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)已被遺傳工程改造成為可以用廉價(jià)的玉米纖維(生產(chǎn)酒精的殘?jiān)?為原料來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素[23]。具體的過(guò)程為：借鑒于歐文氏細(xì)菌(Erwinia amylovora)的改造工作，使用多DNA序列定向克隆技術(shù)，將菌的類異戊二烯途徑重新定向?yàn)橥ㄟ^(guò)類胡蘿卜素生物合成基因合成類胡蘿卜素。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)6d的產(chǎn)量是0.5mg番茄紅素/g干基，目前，實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)一步改進(jìn)中[24]。

1.3 蝦青素

蝦青素添加在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中用以改善魚及甲殼動(dòng)

物的體色。據(jù)報(bào)道稱蝦青素對(duì)人類有很重要的保健功能，所以將其作為營(yíng)養(yǎng)型食品添加劑有很大的意義。雖然化學(xué)合成蝦青素仍然是市場(chǎng)的主導(dǎo)，但由微藻、酵母菌和細(xì)菌通過(guò)生物技術(shù)生產(chǎn)蝦青素是現(xiàn)在深入研究的主題[25]。

1.3.1 雨生紅球藻

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)屬綠藻。其體內(nèi)的蝦青素積累量能夠達(dá)到0.2～2g/100g干基[26]。美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已允許利用雨生紅球藻生產(chǎn)的蝦青素用于食品，幾個(gè)歐洲國(guó)家也已經(jīng)批準(zhǔn)將其作為膳食補(bǔ)充劑。

雨生紅球藻屬于淡水藻，在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下都能生長(zhǎng)。在戶外環(huán)境中很容易受到其他不良物種的污染。其生長(zhǎng)溫度在20～28℃范圍內(nèi)，光照度在15klx，pH值在6.8～7.4之間。此條件下，它很容易受到細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物的污染。所以，戶外培養(yǎng)雨生紅球藻需要盡量減少污染，適當(dāng)控制光照和溫度等環(huán)境條件。在培養(yǎng)過(guò)程中如改變物理?xiàng)l件和細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，可影響雨生紅球藻的生長(zhǎng)和其體內(nèi)類胡蘿卜素的積累。高光照強(qiáng)度會(huì)顯著地影響其細(xì)胞的生長(zhǎng)?？尚械脑逦r青素商業(yè)生產(chǎn)技術(shù)需要一個(gè)有效的封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)和篩選比野生菌株耐高溫的高產(chǎn)藻株。目前在印度、日本和美國(guó)都有成功的商業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái)，人們又研究出用帶有人工光照的封閉生物反應(yīng)器與戶外池塘聯(lián)用的生產(chǎn)技術(shù)來(lái)培養(yǎng)雨生紅球藻[27]。

與杜氏藻不同，雨生紅球藻在生長(zhǎng)過(guò)程中游動(dòng)的鞭毛細(xì)胞變?yōu)椴贿\(yùn)動(dòng)的厚壁孢子。在這些不動(dòng)的孢子內(nèi)會(huì)積累蝦青素[28]。不動(dòng)孢子內(nèi)蝦青素含量一般在1～2g/100g干基范圍內(nèi)。但在提取蝦青素之前需要對(duì)其厚壁進(jìn)行物理破碎[29]。

1.3.2 紅法夫酵母

在能夠生產(chǎn)蝦青素的微生物中，紅法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)很適合商業(yè)生產(chǎn)蝦青素[30]，但產(chǎn)品是(3R，3 R)異構(gòu)體(圖1b)。不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如蛋白胨、麥芽和酵母提取液等)對(duì)紅法夫酵母生長(zhǎng)的影響已經(jīng)有過(guò)許多報(bào)道。同時(shí)，使用許多農(nóng)副產(chǎn)品(如糖蜜、木材水解產(chǎn)物、玉米漿、甘蔗渣、甘蔗汁、葡萄汁等)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的嘗試也有不少。蝦青素產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件是：溫度19.7℃、碳源11.25g/L、pH6.0、接種量為體積分?jǐn)?shù)5%。在這種條件下，蝦青素的含量可達(dá)到8.1mg/L[31]。通過(guò)補(bǔ)料分批培養(yǎng)(在有限的培養(yǎng)基中補(bǔ)加培養(yǎng)液)的方法發(fā)現(xiàn)發(fā)酵方法也會(huì)影響紅法夫酵母的生長(zhǎng)和類胡蘿卜素的積累。恒定pH值培養(yǎng)(為調(diào)整pH值而加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))條件下最高的菌株含量在17.4g/L[32]。同時(shí)，突變株的傳代與優(yōu)化也已經(jīng)開(kāi)始研究[33]。在理論層面，蝦青素生物合成的途徑和過(guò)程也在引起人們的關(guān)注。

在作為動(dòng)物飼料時(shí)，為了提高動(dòng)物腸道對(duì)蝦青素的吸收率，也必須破壞發(fā)酵菌株的細(xì)胞壁。已有化學(xué)、物理、自溶和酶法破壞細(xì)胞壁的方法。關(guān)于蝦青素產(chǎn)量的改善技術(shù)每年都有新的專利申請(qǐng)。目前最高的含量已經(jīng)達(dá)到了3mg/g干基[34]。

1.3.3 橙黃農(nóng)桿菌

蝦青素是存在于橙黃農(nóng)桿菌(A g r o b a c t e r i u m aurantiacum)中10種類胡蘿卜素的一種。蝦青素在其體內(nèi)的生物合成途徑已經(jīng)被研究過(guò)[35]。影響其體內(nèi)類胡羅卜素積累的生長(zhǎng)條件和蝦青素葡萄糖甙的產(chǎn)生過(guò)程已有報(bào)道，但是還沒(méi)在商業(yè)應(yīng)用上應(yīng)用。

為了尋找新的蝦青素細(xì)菌來(lái)源，人們已經(jīng)進(jìn)行了許多篩選工作，分離出了一些可能的目標(biāo)菌株。如球菌和嗜鹽桿菌[36-37]。后者尤為具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椋?)培養(yǎng)液中高質(zhì)量濃度的氯化鈉(20g/100mL)會(huì)防止其他雜菌的污染，所以不需要嚴(yán)格的滅菌措施；2)氯化鈉在15g/100mL的質(zhì)量濃度時(shí)就能夠誘導(dǎo)細(xì)菌解體。因此，不需要特殊的細(xì)胞破碎技術(shù)，就可以對(duì)色素進(jìn)行提取。提取溶媒可以直接用葵花油而不用有機(jī)溶劑。這樣就消除了產(chǎn)品中的溶劑殘留，而且加速了動(dòng)物對(duì)色素的吸收。然而，這種技術(shù)還沒(méi)發(fā)展為商業(yè)技術(shù)。

1.4 玉米黃質(zhì)

玉米黃質(zhì)能夠增強(qiáng)鳥(niǎo)綱動(dòng)物(如家禽)外表的黃色或者是其蛋黃的顏色[38]，可以作為著色劑應(yīng)用在化妝品和食品中。同時(shí)，它還具有維持眼健康的功能。

在20世紀(jì)60年代，人們已分離出了幾種能夠產(chǎn)生玉米黃質(zhì)的海生細(xì)菌。在葡萄糖或蔗糖作為碳源的培養(yǎng)液中培養(yǎng)黃桿菌(Flavobacterium sp.)能夠達(dá)到生產(chǎn)190mg玉米黃質(zhì)/L培養(yǎng)液的水平[39-41]，合16mg/g細(xì)胞干質(zhì)量。目前很多人在研究原黃桿菌(Sphingobacterium multivorum)[42]。這一菌種用在商業(yè)產(chǎn)業(yè)中可大量生產(chǎn)玉米黃質(zhì)。另一種生產(chǎn)玉米黃質(zhì)的菌是黃質(zhì)菌(Zeaxanthinifaciens)。最近，它被重新分類為副球菌種[43]。

1.5 角黃質(zhì)

多年來(lái)，角黃質(zhì)已被用于水產(chǎn)飼料中形成和增添鮭魚、鱒魚所需的肉色。人體過(guò)量的攝入角黃素可導(dǎo)致在人眼中有微小的晶體沉積。所以，角黃素作為一種食品補(bǔ)充劑還不能被人們接受，在水產(chǎn)飼料上也受到一定的限制。

一些細(xì)菌有希望用于角黃素的商業(yè)生產(chǎn)。有一種能夠生產(chǎn)角黃素的慢生菌(Bradyrhizobium sp.)[44]，其合成類胡蘿卜素的基因組已經(jīng)被全部測(cè)出。另一種微生物是極端嗜鹽古菌(Haloferax alexandrinus)。由于嗜鹽古菌積累C50-類胡蘿卜素，所以大部分菌體都是紅色的。據(jù)報(bào)道，有些種能夠合成C40-胡蘿卜素以及一些酮基類胡

蘿卜素。由于這些嗜鹽古菌獨(dú)特的功能在生物技術(shù)上有很大的應(yīng)用潛力，進(jìn)而給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了極大便利。例如，培養(yǎng)基中極高的氯化鈉濃度(15%～30%)，可以阻止其他微生物的污染，所以培養(yǎng)時(shí)可以不需要高壓滅菌[45]。另外，因?yàn)榧?xì)胞在淡水中能夠發(fā)生自溶[46]，不需要細(xì)胞破碎設(shè)備。用1L的搖瓶培養(yǎng)，在開(kāi)放的培養(yǎng)條件下，可生產(chǎn)3g干質(zhì)量的物質(zhì)，其中含總類胡蘿卜素有6mg和2mg的角黃素[47]。

第3種細(xì)菌是戈登氏菌(Gordonia jacobea)，為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌[48]。通常在常規(guī)空氣采樣過(guò)程中分離出體內(nèi)以角黃素為主色素的粉紅色菌落[49]。初次得到的野生菌落中類胡蘿卜素的含量較低。但是，經(jīng)過(guò)幾輪的突變篩選后，可得到角黃素含量比野生菌株多6倍的突變體。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基，可實(shí)現(xiàn)角黃素的含量在1～13.4mg/L之間[49]。這個(gè)突變種，從工業(yè)觀點(diǎn)上看存在著一些潛在的優(yōu)勢(shì)：1)最佳的生長(zhǎng)溫度和類胡蘿卜素積累溫度是30℃，這是發(fā)酵罐中最易實(shí)現(xiàn)的溫度條件；2)廉價(jià)的葡萄糖是菌體生長(zhǎng)和色素積累的最佳碳源；3)乙醇能夠直接萃取總色素的90%以上，所以，萃取物很安全[50]。

2 從轉(zhuǎn)基因微生物中生產(chǎn)類胡蘿卜素的前景

所謂代謝工程是指在活細(xì)胞內(nèi)，利用重組DNA技術(shù)來(lái)修改細(xì)胞的代謝系統(tǒng)，使活細(xì)胞能夠合成(代謝)出所需要的化學(xué)物質(zhì)，并獲得高產(chǎn)量。最理想的載體是能夠自然合成所需化學(xué)物質(zhì)的微生物。但能夠自身合成所需化學(xué)物質(zhì)前體的微生物也是很有價(jià)值的[51]。

人們已經(jīng)從不同的微生物中分離出大量基因，它們能夠編碼類胡蘿卜素生物合成所需的酶和調(diào)控類胡蘿卜素的生物合成。這些基因的功能也已經(jīng)被鑒定出。

一些細(xì)菌(如大腸桿菌)不能自身合成類胡蘿卜素，但引入類胡蘿卜素合成基因后就能夠發(fā)生類胡蘿卜素生物合成過(guò)程。大腸桿菌本身能夠合成異戊二烯化合物(如長(zhǎng)鏈醇和醌)。因此，將類胡蘿卜素合成基因引入后，原有合成代謝物為類胡蘿卜素的生物合成提供可行的直接碳通量。目前，由質(zhì)粒攜帶的能夠合成番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)的類胡蘿卜素合成基因，已經(jīng)在大腸桿菌中重組和表達(dá)出。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌中積累的番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)已經(jīng)可以達(dá)到0.2～1.3mg/g干基的產(chǎn)量；實(shí)際上，除了少數(shù)如玉米黃質(zhì)C(5,6)環(huán)氧化酶基因外，幾乎所有的類胡蘿卜素生物合成基因克隆均能夠在大腸桿菌中表達(dá)[52]。

為了進(jìn)一步增加類胡羅卜素合成量，對(duì)于生物技術(shù)最重要的挑戰(zhàn)是合成過(guò)程的調(diào)控[53]。據(jù)報(bào)道，合理控制丙酮酸和甘油三磷酸的比例，番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)到25mg/g干基[54]。類胡蘿卜合成素基因所編碼的酶活性應(yīng)當(dāng)存在著一個(gè)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)的表現(xiàn)應(yīng)該是：在一個(gè)類胡蘿卜素合成系統(tǒng)中，當(dāng)沒(méi)有中間合成代謝物池(貯存庫(kù))時(shí)，如果合成的終端產(chǎn)物數(shù)量減少，合成前體物的轉(zhuǎn)化效率應(yīng)當(dāng)增加。即：這應(yīng)當(dāng)是一個(gè)“負(fù)反饋調(diào)節(jié)”系統(tǒng)。換言之，目標(biāo)基因重組質(zhì)粒的重要作用之一應(yīng)當(dāng)是減少中間物的積累，提高最終產(chǎn)物的產(chǎn)量。最后，宿主生物體應(yīng)表現(xiàn)出極活躍的萜類合成途徑和具有較高的類胡蘿卜素終端產(chǎn)物的存儲(chǔ)能力。

除了大腸桿菌，食用酵母、朊假絲酵母和釀酒酵母在引入類胡羅卜素基因后也具有合成類胡蘿卜素的能力[55]。

現(xiàn)在很多分子生物學(xué)技術(shù)在這個(gè)領(lǐng)域中是可行的，但還有許多問(wèn)題有待解決，尤其是在涉及到控制最終產(chǎn)品上。在許多情況下，人們的目的是獲得單一的目標(biāo)產(chǎn)物和積累高濃度的類胡蘿卜素，而不是一個(gè)復(fù)雜的混合物。這使工作的難度增加很多。

3 前 景

在無(wú)盡的大自然中有非常多的微生物可以合成類胡蘿卜素。在市場(chǎng)上消費(fèi)者的接受程度、法規(guī)監(jiān)管部門的批準(zhǔn)以及把產(chǎn)品推向市場(chǎng)所需的投資影響著發(fā)酵生產(chǎn)的類胡蘿卜素產(chǎn)品的最終成功。在過(guò)去很長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，因?yàn)榘嘿F的發(fā)酵設(shè)施、監(jiān)管機(jī)構(gòu)的嚴(yán)格要求以及長(zhǎng)期的毒理研究，人們對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素提出了許多質(zhì)疑。然而，現(xiàn)在的情況已經(jīng)有所好轉(zhuǎn)。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有一些由發(fā)酵生產(chǎn)的類胡蘿卜素產(chǎn)品在銷售，這反映了消費(fèi)者的認(rèn)可程度。有理由相信，發(fā)酵法的產(chǎn)品在未來(lái)的市場(chǎng)會(huì)有一個(gè)良好的前景。

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Research Progress of Carotenoids of Microbial Origin

ZHAO Ting，LIN Kong-liang，HUI Bo-di*
(College of Applied Arts & Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The importance of carotenoids to human health is increasingly attracting people s attention. More and more carotenoid based functional foods are coming to markets. It is a tendency to progressively replace synthetic compounds and phytochemicals by low-cost, high-purity and safe products of microbial origin to meet the ever-increasing consumer demand for carotenoids. This article reviews the distribution, sources, production techniques and market potential of carotenoids of microbial origin in an effort to provide

for more effective utilization of this resource and the research and development of production techniques for safer and premium carotenoids based products.

carotenoid；microorganism；microalgae；trans-gene

TS201.24

A

1002-6630(2010)23-0461-06

2010-09-17

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI58B06)

趙婷(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)制備及生理功能。E-mail：zhaoting72886@163.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)轭惡}卜素生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn