白藜蘆醇對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響

陳思凡，柯梁汝，鄭 琳，單智銘，周妮曼，馮 翔,*

(1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室，廣東 廣州 510089；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510089)

白藜蘆醇對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響

陳思凡1，柯梁汝2，鄭 琳1，單智銘2，周妮曼2，馮 翔1,*

(1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室，廣東 廣州 510089；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510089)

目的：研究白藜蘆醇(resveratrol，Res)對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響，并探討其分子機制。方法：用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1細胞建立胰島素抵抗模型，用不同劑量Res進行干預(yù)，添加或不添加胰島素刺激，測定各組細胞的葡萄糖消耗量，實時熒光定量PCR檢測各組細胞的脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)和抵抗素(resistin)mRNA表達，Western blotting檢測腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的蛋白質(zhì)表達及磷酸化水平。結(jié)果：各組細胞經(jīng)胰島素刺激，0.01、0.1、1μmol/L的Res組的葡萄糖消耗量分別是對照組的1.3、1.5、1.4倍(P＜0.05)，添加Res可促進脂聯(lián)素、瘦素mRNA的表達，降低抵抗素mRNA表達，增加AMPKα的磷酸化水平。結(jié)論：Res可以明顯改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1細胞葡萄糖代謝。其機制可能是通過增加脂聯(lián)素、瘦素表達，降低抵抗素表達從而介導(dǎo)AMPKα磷酸化實現(xiàn)的。

白藜蘆醇；胰島素抵抗；脂聯(lián)素；瘦素；抵抗素；脂肪細胞；糖代謝

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎等作用，可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域。研究表明，Res對于組織和細胞能量代謝有廣泛的影響，可通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運子(glucose transporter，Glut)的表達來增加骨骼肌細胞的葡萄糖攝取[1]，還可以減少脂肪細胞的脂質(zhì)形成，抑制前脂肪細胞向脂肪細胞分化[2]。然而，有關(guān)Res對于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞的葡萄糖代謝的作用及機制研究相對較少。本實驗選取3T3-L1脂肪細胞作為研究對象，旨在探討Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1細胞葡萄糖代謝的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

白藜蘆醇、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、合成人胰島素 美國Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清 美國Gibco公司；葡萄糖診斷試劑盒 瑞士Roche公司；Trizol 美國Invitrogen公司；Real time PCR試劑盒 日本TaKaRa公司；兔抗AMPKα、AMPKα Thr172單克隆抗體 美國CST公司；兔抗GAPDH單克隆抗體 Boster公司；BCA試劑盒、HRP標(biāo)記的抗兔二抗 Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1脂肪細胞的誘導(dǎo)分化

3T3-L1前脂肪細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞匯合后接觸抑制48h，換用含0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后換用含10mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，隨后再換用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換液1次，培養(yǎng)4d，90%以上細胞分化為成熟脂肪細胞。

1.2.2 胰島素抵抗模型的建立

對3T3-L1脂肪細胞進行分組，添加1μmol/L的地塞米松作為胰島素抵抗模型組，培養(yǎng)24h后給予100nmol/L的胰島素，刺激15min后取培養(yǎng)基，計算培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量，與非胰島素抵抗組(100nmol/L胰島素刺激15min)對比，評價胰島素抵抗的程度。

1.2.3 葡萄糖消耗量的測定

建立胰島素抵抗模型后，分別添加0、0.01、0.1、1μmol/L的Res，作用24h，每個劑量組平行分為兩組，給予或不給予100nmol/L的胰島素刺激15min，收集各組的培養(yǎng)基，按照葡萄糖診斷試劑盒說明書，在全自動生化分析儀上測定各實驗組和原DMEM培養(yǎng)基的葡萄糖含量，葡萄糖消耗量為DMEM培養(yǎng)基葡萄糖量與實驗組培養(yǎng)基葡萄糖量之差。以不加任何藥物的組別為對照組，此組的葡萄糖消耗量設(shè)為100，其他組與之相比。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達

細胞經(jīng)實驗干預(yù)后用Trizol抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT步驟：取1g/L的RNA 1μL，分別加入4μL的5×PrimeScriptTMBuffer、1μL的RT Enzyme Mix Ⅰ、1μL的Oligo dT Primer、1μL的Random 6 mers，補充13μL的DEPC水，RT反應(yīng)液總體積為20 μL，37℃ RT 15min，85℃ 5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶。RT后以cDNA為模板進行擴增。PCR步驟：取2μL的cDNA溶液，分別加入10 μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM、0.4μL的Forward Primer、0.4μL的Reverse Primer、0.4μL的50×ROX Reference DyeⅡ，補充6.8μL的dH2O，PCR反應(yīng)液總體積為20μL。擴增條件：95℃預(yù)變性30s，95℃ 5s變性、55℃ 30s退火、72℃ 30s延伸，擴增40個循環(huán)。引物為：脂聯(lián)素正義鏈5＇-GTC AGT GGA TCT GAC GAC ACC AA-3＇、反義鏈5＇-ATG CCT GCC ATC CAA CCT G-3＇，PCR產(chǎn)物171bp；瘦素正義鏈5＇-CCA GGA TCA ATG ACA TTT CAC ACA C-3＇、反義鏈5＇-AGG TCA TTG GCT ATC TGC AGC AC-3＇，PCR產(chǎn)物184bp；抵抗素正義鏈5＇-TTG GCT TAA ATT GCT GGA CAG TCT C-3＇、反義鏈5＇-GGA AGC GAC CTG CAG CTT ACA-3＇，PCR產(chǎn)物191bp；β-actin正義鏈5＇-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C-3＇、反義鏈5＇-ATG GAG CCA CCG ATC CAC A-3＇，PCR產(chǎn)物171bp。Real time PCR反應(yīng)引物由TaKaRa公司設(shè)計并合成。用Sequence Detection System軟件分析各組的循環(huán)閥值(Ct)，通過計算2－△△Ct得出各組基因的相對表達水平。

1.2.5 Western blotting檢測AMPKα蛋白表達及磷酸化水平

用NP-40裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120V、80mA預(yù)電泳10min，上樣，進行SDS-PAGE電泳，半干式轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗按照1:1000的稀釋度于4℃孵育過夜，二抗(1:5000)室溫孵育1h，暗房中滴加發(fā)光底物混合物2mL于膜上，用X光片曝光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，各組比較采用單因素方差分析，組間比較用Bonferroni法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

正常狀態(tài)下3T3-L1脂肪細胞經(jīng)胰島素刺激后，葡萄糖的消耗量極顯著增加(P＜0.01)。添加地塞米松后，加胰島素刺激，與對照組相比，葡萄糖消耗量無明顯變化，說明細胞出現(xiàn)胰島素抵抗(圖1A)。用0、0.01、0.1、1μmol/L的Res處理胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的細胞，經(jīng)胰島素刺激后，各處理組與對照組比較，葡萄糖消耗量均顯著增加(P＜0.05)，而未經(jīng)胰島素刺激，與對照組比較，0.1μmol/L處理組葡萄糖消耗量增加(P＜0.05，圖1B)。

圖1 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 Effect of resveratrol on glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

2.2 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達的影響

圖2 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達的影響Fig.2 Effect of resveratrol on mRNA expression of adiponectin, leptin and resistin of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

由圖2可知，給予或不給予胰島素刺激，與相應(yīng)的對照組比較，Res組脂聯(lián)素的mRNA表達均顯著增加(P＜0.05，圖2A)；不給予胰島素刺激，與對照組比較，0.1、1μmol/L的Res組瘦素的mRNA表達顯著增加(P＜0.05)，而給予胰島素刺激，3個劑量組瘦素的mRNA表達均顯著增加(P＜0.05，圖2B)；給予或不給予胰島素刺激，與對照組比較，0.1、1μmol/L的Res組抵抗素的mRNA表達顯著下降(P＜0.05，圖2C)。

2.3 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞AMPKα蛋白表達及磷酸化水平的影響

圖3 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞AMPKα的蛋白表達及磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of resveratrol on the phosphorylation of AMPK|á in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

由圖3可知，給予或不給予胰島素刺激，與相應(yīng)的對照組比較，R es組的p-A MPKα表達升高，即AMPKα Thr172的磷酸化水平增加，而AMPKα的總蛋白表達無明顯變化。

3 討 論

胰島素與細胞膜上的胰島素受體結(jié)合后，激活受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致自身磷酸化和胰島素受體底物(IRS)的酪氨酸磷酸化。活化的IRS可磷酸化下游的PI3K和akt，從而促進Glut4遷移到胞膜上介導(dǎo)組織細胞利用葡萄糖[3]。體內(nèi)和體外研究證明，Res可以增加依賴或非依賴胰島素的葡萄糖轉(zhuǎn)運[4]，其機制尚不完全清楚。本實驗結(jié)果顯示，無論胰島素存在與否，Res均能增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的攝取，但在有胰島素刺激時，3種濃度的Res組均正向促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，而在缺乏胰島素刺激的條件下，只有0.1μmol/L的Res組增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細胞葡萄糖的攝取，提示Res改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細胞的葡萄糖代謝可能通過IRS-PI3K-akt- Glut4通路，而且可能還存在其他不依賴胰島素的通路，有待進一步的探討。

脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素都是脂肪細胞分泌的因子。研究顯示，脂聯(lián)素可增加胰島素的敏感性和脂肪組織的氧化，最終減少循環(huán)中脂肪酸水平和減少肝臟和脂肪細胞的TG水平[5]，從而改善胰島素抵抗。有研究證明，恒河猴自發(fā)展為2型糖尿病的過程中，脂聯(lián)素含量下降，高胰島素鉗夾實驗顯示，隨著胰島素抵抗的加重，血中脂聯(lián)素水平逐漸降低[6]。本實驗結(jié)果顯示，無論胰島素存在與否，Res都可使胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素的mRNA表達增加，提示Res可能通過增加脂聯(lián)素的表達水平來改善胰島素抵抗。

瘦素主要是由白色脂肪組織分泌的，且只有在成熟的脂肪細胞中才表達[7]。瘦素通過中樞神經(jīng)遞質(zhì)抑制食欲，促進糖脂代謝，參與多種內(nèi)分泌激素的相互協(xié)調(diào)，以控制肥胖的發(fā)生發(fā)展[8]。在對3T3-L1細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，瘦素不能直接誘導(dǎo)脂肪細胞凋亡，但能直接抑制前脂肪細胞的成熟分化，減少細胞中的脂質(zhì)堆積[9]。本實驗結(jié)果顯示，Res組瘦素mRNA表達增加，提示Res改善胰島素抵抗可能與增加瘦素的表達有關(guān)。

抵抗素是由脂肪細胞分泌的多肽類激素。研究表明，在胰島素抵抗的動物體內(nèi)抵抗素水平明顯高于正常個體，降低血清抵抗素水平能減少脂肪沉積，提高胰島素的敏感性[10]。抵抗素通過降低胰島素刺激的葡萄糖攝取來降低脂肪細胞、骨骼肌細胞和肝細胞以及胰腺β細胞的胰島素敏感性，誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過或不經(jīng)過胰島素刺激，0.1、1μmol/L的Res組抵抗素的mRNA表達都下降，因此推測Res改善胰島素抵抗可能與下調(diào)抵抗素的表達有關(guān)。

AMPK廣泛存在于真核細胞中，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是一個異源三聚體，由具有催化作用的α亞基和具有調(diào)節(jié)作用的β和γ亞基構(gòu)成，α亞基對整個激酶的活性是必需的。當(dāng)代謝性應(yīng)激引起細胞內(nèi)AMP/ATP比值升高時，AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游靶分子，減少ATP的消耗和增加ATP的生成，即促進分解代謝；當(dāng)AMP/ATP比值降低時，AMPK則促進合成代謝。對2型糖尿病患者和正常對照組進行的體外實驗顯示，5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸(AICAR，AMPK的激活劑)通過增加細胞表面Glut4含量，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運，這一過程依賴AMPK途徑[11]。在大鼠原代脂肪細胞中，脂聯(lián)素可通過磷酸化AMPK和ACC，促進細胞攝取葡萄糖[12]。在骨骼肌細胞中，瘦素可激活A(yù)MPKα2 亞單位的活性，加速脂肪酸氧化作用[13]。抵抗素可通過抑制AMPK活性而作用于脂肪、肝臟及骨骼肌等胰島素靶器官，促進肝糖輸出，導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素抵抗[14-15]。本實驗結(jié)果顯示，無論胰島素存在與否，Res都增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞AMPKα的磷酸化水平。提示Res可能通過增加細胞脂聯(lián)素與瘦素的表達，減少抵抗素的表達，從而增加AMPKα磷酸化，活化AMPKα經(jīng)或不經(jīng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(IRSPI3K-akt)，促進Glut4的轉(zhuǎn)位，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運，改善胰島素抵抗。

綜上所述，Res增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖代謝，改善其胰島素抵抗。Res可能通過增加脂聯(lián)素和瘦素的表達并下調(diào)抵抗素的表達，進而增加AMPK的磷酸化水平，經(jīng)過或不經(jīng)過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加葡萄糖攝取。本研究結(jié)果可為Res防治2型糖尿病及其他代謝綜合征提供理論依據(jù)。

[1] CUCCIOLLA V, BORRIELLO A, OLIVA A, et al. Resveratrol: from basic science to the clinic[J]. Cell Cycle, 2007, 6(20): 2495-2510.

[2] PANG Weijun, SUN Shiduo, BAI Liang, et al. Effects of resveratrol on pig primary preadipocytes proliferation, differentiation and transcription expression of Sirt1 gene[J]. Chin J Biotechnol, 2006, 22(5): 850-855.

[3] PENDE M, KOZMA S C, JAQUET M, et al. Hypoinsulinaemia, glucose intolerance and diminished beta-cell size in S6K1-deficient mice[J].Nature, 2000, 408(6815): 994-997.

[4] DENG Jenying, HSIEH P S, HUANG Jiungpang, et al. Activation of estrogen receptor is crucial for resveratrol stimulating muscular glucose uptake via both insulin-dependent and independent pathways[J]. Diabetes,2008, 57(7): 1814-1823.

[5] BERG A H, COMBS T S, SCHERER P E. ACRP30/adiponectin: an adipokine regulating glucose and lipid metabolism[J]. Trends Endocrinol Metab, 2002, 13(2): 84-89.

[6] HOTTA K, FUNAHASHI T, BODKIN N L, et al. Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesusmon-keys[J]. Diabetes, 2001, 50(5): 1126-1133.

[7] 段剛, 許慕強, 張福平, 等. 糖尿病及肥胖患者血漿瘦素水平的檢測[J]. 中國病理生理雜志, 2003, 19(6): 831-855.

[8] 寧鴻珍, 李清釗, 劉英莉, 等. 茶多酚對肥胖大鼠體重的影響及其與瘦素、血脂水平的關(guān)系[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4): 358-360.

[9] AMBATI S, KIM H K, YANG J Y, et al. Effects of leptin on apoptosis and adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes[J]. Biochem Pharmacol, 2007,73(3): 378-384.

[10] STEPPAN C M, BAILEY S T, BHAT S T, et al. The hormoneresistin links obesity to diabetes[J]. Nature, 2001, 409(3): 307-312.

[11] KOISTINEN H A, GALUSKA D, CHIBALIN A V, et al. 5-aminoimidazole carboxamide riboside increases glucose transportand cell surface GLUT4 content in skeletal muscle from subjects with type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2003, 52(5): 1066-1072.

[12] WU Xiangdong, MOTOSHIMA H , MAHADEV K, et al. Involvement of AMP-activated protein kinase in glucose uptake stimulated by the globular domain of adiponectin in primary rat adipocytes[J]. Diabetes,2003, 52(6): 1355-1363.

[13] MINOKOSHI Y, ALQUIER T, FURUKAWA N, et al. AMP-kinase regulates food intake by responding to hormonal and nutrient signals in the hypothalamus[J]. Nature, 2004, 428(6982): 569-574.

[14] PALANIVEL R, SWEENEY G. Regulation of fatty acid uptake and metabolism in L6 skeletal muscle cells by resistin[J]. FEBS Lett, 2005,579(22): 5049-5054.

[15] FILKOVA M, HALUZIK M, GAY S, et al. The role of resistin as a regulator of inflammation: Implications for various human pathologies[J]. Clin Immunol, 2009, 133(2): 157-170.

Effect of Resveratrol on Glucose Metabolism in Insulin-resistant 3T3-L1 Adipocytes

CHEN Si-fan1，KE Liang-ru2，ZHENG Lin1，SHAN Zhi-ming2，ZHOU Ni-man2，F(xiàn)ENG Xiang1,*
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food, Nutrition and Health, School of Public Health, Sun Yat-sen University,Guangzhou 510089, China；2. Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510089, China)

Objective: To explore the effect and mechanism of resveratrol on glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. Methods: Insulin-resistant model was established by the induction of dexamethasone in 3T3-L1 adipocytes. The glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes with and without resveratrol stimulation was determined. The mRNA expression of leptin, adiponectin and resistin was determined by real time PCR, and the expression and phosphorylation of AMPK α were determined by Western blotting. Results: After insulin stimulation with the concentration of 0.01, 0.1μmol/L and 1μmol/L, resveratrol could increase the glucose consumption by 1.3, 1.5 folds and 1.4 folds compared with the control (P ＜ 0.05).Meanwhile, resveratrol could increase mRNA expression of adiponectin and leptin and decrease mRNA expression of resistin.Moreover, resveratrol increased the phosphorylation of AMPKα. Conclusion: Resveratrol can improve glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. The molecular mechanism may be the phosphorylation of AMPK α by increasing the expression of adiponectin and leptin and inhibiting the expression of resistin.

resveratrol；insulin resistance；adiponectin；leptin；resistin；fat cells；AMPK

Q946.8

A

1002-6630(2010)23-0285-04

2010-03-22

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(A2010143)

陳思凡(1984—)，男，碩士，研究方向為營養(yǎng)與健康。E-mail：dishi1984@126.com

馮翔(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為營養(yǎng)與健康。E-mail：fengx@mail.sysu.edu.cn