越橘果實花色苷的體外抗氧化性

呂春茂，王新現(xiàn)，包 靜，孟憲軍，董文軒*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

越橘果實花色苷的體外抗氧化性

呂春茂1,2，王新現(xiàn)2，包 靜2，孟憲軍2，董文軒1,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

采用還原能力測定、清除羥自由基(·OH)能力、清除超氧陰離子自由基(O2·)能力和對DPPH自由基的抑制作用對高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生品種越橘果實花色苷進(jìn)行體外抗氧化活性研究，并測定其中花色苷含量。結(jié)果表明：花色苷粗品中藍(lán)豐、北春、美登和野生越橘的花色苷含量依次為19.77、12.67、24.73、32.44mg/g；4種果實花色苷皆有良好的抗氧化活性，在溶液質(zhì)量濃度相同的情況下，4種越橘果實花色苷溶液的抗氧化活性與花色苷含量呈一定的量效關(guān)系，野生越橘的還原能力、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力均最高，矮叢越橘美登次之；而在花色苷含量相同的情況下，高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生品種越橘果實的花色苷抗氧化活性不同，推測是由于其花色苷組分及其含量不同所致。

越橘；花色苷；抗氧化性

越橘(Bilberry)，又稱藍(lán)漿果、藍(lán)莓果，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium.SPP) 多年生落葉或常綠灌木，全世界廣泛分布[1-2]。越橘果實中含有豐富的花色苷等多酚類物質(zhì)，花色苷是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化、清除自由基等多種保健和營養(yǎng)功能[3-5]，它不僅抗氧化效果顯著，且對人體無任何毒副作用，現(xiàn)對其開發(fā)應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。楊桂霞[6]和李亞東等[7]均報道越橘不同品種間花色苷含量有很大的差別，但其抗氧化能力是否有差別鮮有報道。為充分利用越橘植物資源，本研究對3個栽培種和1個野生種越橘果實提取物進(jìn)行花色苷含量測定，并對其體外抗氧化作用進(jìn)行比較研究，旨在為越橘屬功能性食品及天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

越橘栽培品種藍(lán)豐(Bluecrop，高叢越橘品種群)、北春(N o r t h c o u n t r y，半高叢越橘品種群)、美登(Blomidon，矮叢越橘品種群)和野生越橘(Vaccinium

uliginosum Linn.)果實于2009年6月分別采自沈陽農(nóng)業(yè)科技開發(fā)園和長白山，冰袋冷藏運輸，-20℃冷凍儲藏。

NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、無水碳酸鈉、沒食子酸、蛋黃卵磷脂、抗壞血酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亞鐵、冰乙酸、三氯化鐵、六氰合鐵酸鉀[K3Fe(CN)6]、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、水楊酸、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、30%過氧化氫、三羥基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚，均為分析純。

FD-IC-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FW80-1高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造。

1.2 方法

1.2.1 越橘花色苷的制備

將越橘果實制成凍干粉，凍干粉經(jīng)超聲波輔助提取，提取液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得紫黑色花色苷粗品干粉。準(zhǔn)確稱取花色苷粗品0.1000g，用60%的乙醇溶液進(jìn)行溶解并定溶至100mL，于冰箱中冷藏備用。另外準(zhǔn)確稱取抗壞血酸(VC)0.1000g，用60%的乙醇溶液溶解定溶至100mL容量瓶，制成越橘花色苷抗氧化性比較的對照液。于546nm波長處測定花色苷色素溶液的吸光度，花色苷含量計算公式[8]為：

式中，A為最大吸收峰位置處的吸光度；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；V1為供試液體積/mL；V2為提取液總體積/mL；V3為吸取V2中用于檢測的提取液體積/mL；m為樣品的初質(zhì)量/g。

1.2.2 越橘花色苷還原能力的測定

采用普魯士藍(lán)法[9-10]。分別準(zhǔn)確移取1mL適當(dāng)濃度的花色苷提取液和VC 溶液，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 六氰合鐵酸鉀溶液(K3Fe(CN)6)，于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的三氯乙酸(TCA)，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm波長處測定其吸光度。

1.2.3 越橘花色苷清除·OH能力的測定

參照Smirnoff等[11]的方法并略加改動。反應(yīng)體系中含8.8mmol/L H2O21mL，10mmol/L FeSO41mL，10mmol/L水楊酸-乙醇1mL，分別移取1mL花色苷提取液和VC 溶液，加H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水作參比，在510nm波長處測定各濃度的吸光度，按式(1)計算清除率。

式中：A0為對照液的吸光度；A1為加入花色苷溶液后的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2花色苷溶液的吸光度；抗壞血酸作陽性對照。

1.2.4 越橘花色苷O2·清除率的測定

1.2.4.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定[12-13]

取4.5mL pH 8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液和4.2mL蒸餾水，混勻后在25℃恒溫水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5min在320nm波長處測定溶液的吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加(ΔA0)。

1.2.4.2 樣品活性測定

取4.5mL pH 8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液和3.3mL蒸餾水，混勻后在25℃恒溫水浴中保溫20min，取出后準(zhǔn)確移入其中各待測液1mL，加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5min在320nm波長處測定溶液的吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加(ΔA)，計算清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA為加入越橘花色苷后鄰苯三酚的自氧化速率，單位均為吸光度每分鐘的增值。

1.2.5 越橘花色苷清除DPPH自由基能力的測定

參考Yamaguchi等[14]的方法并略作修改。稱取0.1984g DPPH用無水乙醇溶解，定溶至50mL，作為儲備液。吸取2 mL D P P H儲備液，用無水乙醇定溶至100mL，待測。利用紫外-可見分光光度計法測定加抗氧化提取液后在波長517nm處吸收的下降表示其對有機(jī)自由基消除能力，按表2加反應(yīng)液，測定吸光度，以70%乙醇作空白。

用力搖勻，將Ai所表示的樣品在常溫下避光反應(yīng)30min后，加入1cm比色皿中進(jìn)行吸光度的測定，測出A0、Ai、Aj的吸光度，按式(3)進(jìn)行清除率的計算。

式中：吸光度A0為2mL DPPH溶液+2mL 70%乙醇；Ai為2mL DPPH溶液+2mL 樣品溶液；Aj為2mL 70%乙醇+2mL樣品溶液。

1.2.6 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncans’差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘果實花色苷含量

4種越橘果實花色苷粗品溶液(1mg/mL)的花色苷含量比較見圖1。野生越橘的花色苷含量明顯高于3個越橘栽培品種，達(dá)32.44mg/g；在3個越橘栽培品種中，矮叢越橘美登的花色苷含量最高(24.73mg/g)，其次為高叢越橘藍(lán)豐(19.77mg/g)，半高叢越橘北春的花色苷含量最低(12.67mg/g)，且這4個越橘品種間花色苷的含量差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同品種越橘果實花色苷含量的比較Fig.1 Anthocyanins content of different varieties of bilberry

2.2 越橘花色苷還原能力

圖2 1mg/mL質(zhì)量濃度下越橘果實花色苷粗品溶液還原能力的比較Fig.2 Comparison of reducing power of bilberry anthocyanins under the same mass concentration

由圖2可知，在花色苷粗品溶液質(zhì)量濃度相同情況下，VC的還原能力最強(qiáng)(差異顯著，P＜0.05)，野生越橘和矮叢越橘美登次之，高叢越橘藍(lán)豐和半高叢越橘北春最低。

圖3為各越橘果實花色苷粗品溶液在花色苷含量相同情況下的還原能力比較。

圖3 相同花色苷含量越橘果實花色苷還原能力的比較Fig.3 Comparison of reducing power of bilberry anthocyanins under the same anthocyanin content

由圖3可見，高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登和野生越橘的還原能力差異不顯著，且均低于VC的還原能力。

2.3 越橘花色苷清除·OH能力

圖4 1mg/mL質(zhì)量濃度越橘果實花色苷粗品溶液的·OH清除率比較Fig.4 Comparison of removing hydroxyl radical by bilberry anthocyanins under the same mass concentration

由圖4可見，越橘花色苷具有良好的清除·OH能力，清除·OH能力的高低依次為：野生越橘＞矮叢越橘美登＞半高叢越橘北春＞高叢越橘藍(lán)豐，其中野生越橘和矮叢越橘美登的花色苷粗品溶液對·OH的清除率均高于VC，且差異顯著(P＜0.05)；半高叢越橘北春清除·OH的能力與VC相當(dāng)，而高叢越橘藍(lán)豐則低于V C。

圖5 相同花色苷含量越橘果實花色苷的·OH清除率比較Fig.5 Comparison of removing hydroxyl radical of bilberry anthocyanins under the same anthocyanin content

由圖5可知，在花色苷含量相同的情況下，4種果實花色苷溶液對·OH的清除率顯著高于VC；其中半高叢越橘北春和高叢越橘藍(lán)豐對·OH的清除能力相最

強(qiáng)，矮叢越橘美登次之，野生越橘最低，且差異顯著(P＜0.05)。

2.4 越橘花色苷清除O2·能力

圖6 1mg/mL質(zhì)量濃度越橘果實花色苷粗品溶液的O2·清除率比較Fig.6 Effects of bilberry extract on O2·scavenging ability under the same mass concentration

由圖6可知，不同越橘果實花色苷粗品溶液對O2·的清除能力相差很大(P＜0.05)，其中野生越橘果實花色苷對O2·的清除率最高，矮叢越橘美登次之，高叢越橘藍(lán)豐最低；供試的4種越橘果實花色苷粗品溶液對O2·的清除率均低于VC。

圖7 相同花色苷含量越橘果實花色苷的O2·清除率比較Fig.7 Effects of bilberry extract on O2· scavenging ability under the same anthocyanin content

由圖7可知，供試的4種越橘果實花色苷粗品溶液對O2·的清除率均低于VC；矮叢越橘美登、半高叢越橘北春和野生越橘清除O2·的能力相近，顯著高于高叢越橘藍(lán)豐(P＜0.05)。

2.5 越橘花色苷DPPH自由基清除能力

圖8 1mg/mL質(zhì)量濃度越橘果實花色苷粗品溶液的DPPH自由基清除率比較Fig.8 Effects of bilberry extract on DPPH radical scavenging activity under the same mass concentration

由圖8可知，在粗品溶液質(zhì)量濃度相同情況下，野生越橘果實花色苷對DPPH自由基的清除率最高，且與VC相當(dāng)，矮叢越橘美登次之，半高叢越橘北春最低。

在花色苷含量相同情況下各處理對DPPH自由基清除能力的比較結(jié)果見圖9。

圖9 相同花色苷含量越橘果實花色苷的DPPH自由基清除率比較Fig.9 Effects of bilberry extract on DPPH radical scavenging activity under the same anthocyanin content

由圖9可知，半高叢越橘北春清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，顯著高于VC(P＜0.05)，矮叢越橘美登、高叢越橘藍(lán)豐和野生越橘清除DPPH自由基的能力與VC相當(dāng)。

3 討 論

越橘果實中含有豐富的花色苷，野生品種花色苷含量可達(dá)0.33～3.38g/100g鮮質(zhì)量；栽培品種0.07～0.15 g/100g鮮質(zhì)量[15]。近些年來國內(nèi)對越橘花色苷含量的測定已有很多相關(guān)研究，研究表明不同品種間花色苷含量有很大的差別。本研究中，高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生越橘果實花色苷粗品溶液中的花色苷含量亦不相同，且野生越橘果實的花色苷含量明顯高于其他3個栽培品種，這與前人研究結(jié)果相似。

采用還原能力測定、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力對高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生越橘果實花色苷進(jìn)行體外抗氧化活性研究。結(jié)果表明，4種越橘果實的花色苷溶液皆有良好的抗氧化活性。在粗品溶液質(zhì)量濃度為1mg/mL時，野生越橘的還原能力、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力均最高，美登次之，藍(lán)豐和北春較低，總體上看4種越橘果實花色苷溶液的抗氧化活性與花色苷含量呈一定的量效關(guān)系。在花色苷含量相同的情況下，4 種越橘果實花色苷對DPPH自由基清除能力從高到低依次為北春、美登、藍(lán)豐、野生越橘；還原能力從高到低依次為北春、藍(lán)豐、美登、野生越橘；清除·OH能力從高到低依次為北春、藍(lán)豐、美登、野生越橘；清除O2·能力從高到低依

次為美登、北春、野生越橘、藍(lán)豐。由此可見，在花色苷粗品溶液質(zhì)量濃度相同的情況下，由于高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生越橘的果實中所含的花色苷含量不同，導(dǎo)致其抗氧化活性也不同，其中花色苷含量相對較高的野生越橘的抗氧化活性要強(qiáng)于其他3個栽培品種。在花色苷含量相同的情況下，高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生越橘的果實花色苷抗氧化活性也不同，這可能是由于高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生越橘的果實中花色苷組分及其含量不同所導(dǎo)致，越橘果實花色苷的組分及其抗氧化功效還有待于進(jìn)一步研究。

[1]徐璐, 鄭建仙. 歐洲越橘花色苷的研究概況[J]. 中國食品添加劑, 2005 (4): 43-64.

[2]李穎暢, 孟憲軍. 藍(lán)莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2008, 30(4): 427-429.

[3]徐淵金, 杜琪珍. 花色苷生物活性的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2006, 22(6): 154-157.

[4]KONG Jinming, CHIA L S, GOH N K, et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry, 2003, 64: 923-933.

[5]劉岱琳, 於洪建, 劉丹, 等. 花色苷在健康食品中的應(yīng)用[C]//營養(yǎng)強(qiáng)化劑和功能性食品配料國際研討會暨協(xié)會營養(yǎng)強(qiáng)化劑及特種營養(yǎng)食品專業(yè)委員會2006年年會論文集.天津: 中國食品添加劑生產(chǎn)應(yīng)用工會, 2006: 15-20.

[6]楊桂霞. 篤斯越橘花色素的分離鑒定及栽培種花色素的定量分析[D].長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[7]李亞東, 孟凡麗, 鄭毅男, 等. 不同基因型越橘果實中4種花色苷含量的研究[J]. 園藝學(xué)報, 2004, 31(3): 367-368.

[8]王二雷, 林松毅, 劉靜波, 等. 篤斯越桔中花青素含量分析[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10): 460-463.

[9]郭春梅, 武榮蘭, 封順, 等. 香青蘭多糖的提取、測定及其對活性氧自由基的清除作用[J]. 食品發(fā)酵與工業(yè), 2005, 31(3): 129-132.

[10]莫開菊, 柳圣, 程超. 生姜的抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27 (9): 110-115.

[11]SMIRONFF N, CUMBES Q J. Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemisty, 1989, 28(4): 1051-1560.

[12]HALLOIWELL B, GUTTERIDGE J M C. Free radical in biology and medicine[M]. London: Oxford Clarendon Press, 1989.

[13]DUN P D, YEN G C. Antioxidant activities of three herbal water extracts [J]. Food Chem, 1997, 60: 639-645.

[14]YAMAGUCHI T, TAKAMURA H, MATOBA T, et al. HPLC method for evaluation of the free radical-scavenging activity of foods by using1,1-diphe-nyl-2-picrylhydrzyl[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 1998, 62: 1201-1204.

[15]胡雅馨, 李京. 藍(lán)莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 600-603.

in vitro Antioxidant Evaluation of Anthocyanins from Bilberry Fruits

LU Chun-mao1,2，WANG Xin-xian2，BAO Jing2，MENG Xian-jun2，DONG Wen-xuan1,*
(1. College of Horticultural Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

To take full advantage of the bilberry resources, DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging and reducing power assays were used to study the in vitro antioxidant activity of the fruits of cultivated bilberry varieties, including Lanfeng, Beichun, Meideng, and wild bilberry fruits. The contents of polyphenol and anthocyanins were also determined. The results showed that, the anthocyanin content of Lanfeng, Beichun, Meideng and wild bilberry were 19.77, 12.67, 24.73 mg/g and 32.44 mg/g frozen fruit, respectively, and anthocyanin had noticeable antioxidant activities. Among the four varieties of bilberry, the antioxidant activity of wild bilberry was the highest, followed by Meideng. The anthocyanins from the four varieties of bilberry had different antioxidant effects at the same concentrations. It is deduced that this is ascribed to the differences in anthocyanin composition and content.

bilberry；anthocyanins；antioxidant activities

TS255.1

A

1002-6630(2010)23-0027-05

2010-10-09

沈陽市青年人才基金計劃項目(1081240-1-02)；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后科研基金項目

呂春茂(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：bt_lcm@126.com

*通信作者：董文軒(1963—)，男，教授，博士，研究方向為果樹種子資源。E-mail：wxdong63@126.com