一種水溶性苝系衍生物pH熒光探針的合成及表征

馬永山,吳俊森,常乃豐，孫韶華

（1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟南250101）（2.濟南市供排水監(jiān)測中心，山東濟南250033）

0 引言

熒光pH探針是分子探針的一種，廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)(監(jiān)控血液中的pH)和細胞生物學(xué)(量度細胞內(nèi)的pH)等領(lǐng)域[1]。根據(jù)涉及到的基本過程，大多數(shù)熒光pH探針發(fā)生作用的機制有兩類：一類是光誘導(dǎo)電子遷移過程(簡稱PET)，另一類是光誘導(dǎo)電荷遷移過程(簡稱PCT)[2]。這兩類作用機制都是通過質(zhì)子化[3]、氫鍵[4～5]、以及氫質(zhì)子與熒光染料的過渡態(tài)形成不穩(wěn)定化學(xué)鍵來實現(xiàn)的[6]。帶有羧基的苝酰亞胺型熒光染料具有顯著的優(yōu)點：既有親脂性又有親水性(苝骨架使其具備親脂性，羧基的存在又使其兼具親水性)，斯托克斯位移大且熒光量子產(chǎn)率高。既有親脂性又有親水性使其能滲透到細胞內(nèi)，可用于活體組織內(nèi)pH的測定；斯托克斯位移較大可避免吸收光譜干擾發(fā)射光譜，從而提高測試的靈敏度與準確性。因此將帶有胺基的苝酰亞胺類熒光染料開發(fā)作為pH熒光探針具有重要的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。苝二酰亞胺衍生物的合成方法早已有報道[7～8]，該文參考有關(guān)文獻自行設(shè)計合成了含有四個羧基親水性基團的苝二酰亞胺衍生物，并首次研究了它作為pH熒光探針的光譜特性，光譜變化表明：它隨溶液pH的減小熒光強度逐漸降低，可作為pH熒光探針。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

天冬氨酸、氫氧化鉀、二甲基亞砜、濃硫酸、無水乙醇、鹽酸、3,4;9,10-苝四甲酸二酐均為分析純試劑。

1HNMR譜用Varian Inova 400 MHz NMR spectrometer；布魯克TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀；CARY50紫外可見分光光度計；日立F-4500型熒光分光光度計；精密pH計PHS-3C(上海雷磁儀器廠)。

1.2 合成(合成路線如圖1所示)

1.2.1 苝二（天冬氨酸）二酰亞胺的合成[7～8]

準確稱取1.33 g（0.01 mol）天冬氨酸與1.12 g（0.02 mol）KOH的水溶液混合、室溫攪拌過夜，減壓旋轉(zhuǎn)蒸除體系水分，得2.1 g天冬氨酸鉀鹽晶體。將制備的天冬氨酸鉀鹽超聲分散在40 mL DMSO溶液中后，在磁力攪拌下使其回流半小時，再加入0.4 g精制的苝酐繼續(xù)攪拌、回流，每隔30 min取少量樣品在濃硫酸中測可見光譜，直到在500 nm、546 nm左右苝酐的特征吸收峰消失，而在560 nm、600 nm左右出現(xiàn)對稱苝四羧酸二酰亞胺的特征峰，且兩者的相對強度基本不變時停止反應(yīng)。將反應(yīng)后體系離心，沉淀用無水乙醇洗至濾液基本無色，加水用稀鹽酸酸化至pH=1，水洗3次，得到化合物2。

1.2.2 苝二（天冬氨酸銨鹽）二酰亞胺的合成

將化合物2溶解到20 mL 15%的氨水里面，攪拌5 min，過濾得濾液，除掉溶劑得到紅棕色的固體，80℃真空干燥得0.45g產(chǎn)物3，產(chǎn)率約70%。1H-NMR(D2O,TMS,ppm)δ:7.37(d,4H),7.00(d,4H),5.26(m,2H),2.12(s,4H);FTIR(KBr)，ν/cm-1:3 433,3 164(酰胺N-H伸縮振動),3 052(苝環(huán)C-H伸縮振動),2 847（飽和C-H伸縮振動），1 689(羧酸C=O伸縮振動),1 592(苝環(huán)C=C)，1 361,1 345(C-N),1 273,1 182,1 114,1 021,951(羧酸中C-O),853,809,793,737,659,461,432(C-H非平面搖擺);m/z=616[M]+。

圖1 化合物3的合成路線Fig.1 Synthesis route of compound 3

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖2 10-5mol/L的化合物3水溶液的不同pH值的熒光圖（λmax=551 nm）（2×10-3mol/L的磷酸緩沖體系，內(nèi)置圖為化合物3最大熒光強度值與pH值的對應(yīng)圖）Fig.2 The fluorescence spectra of compound 3(10-5mol/L)in water at different pH(2×10-3mol/L phosphate buffer;Insert is the relative fluorescence intensity change of compound 3 at different pH)

圖2為10-5mol/L的化合物3熒光強度隨pH變化的曲線圖，右上角內(nèi)置圖為熒光強度隨pH值變化的改變趨勢圖。化合物3的最大發(fā)射波長為λmax=551 nm，伴隨溶液pH值降低，熒光發(fā)射強度逐漸降低。在pH值由10.75降到9.66時，熒光強度急劇降低，在堿性溶液中化合物3以羧酸根的形式存在，羧酸根陰離子為富電子特征，使整個化合物分子具有較高的電子密度，苝核平面之間存在的斥力阻止了它們的聚集從而獲得高的熒光量子產(chǎn)率；溶液pH從9.66降到5.12時，熒光強度降低緩慢，體系為苝四羧酸及其鹽的緩沖溶液，發(fā)光物種比較穩(wěn)定，熒光強度降低幅度不大；當(dāng)pH值降低到5.12以下，熒光強度迅速降低直至淬滅，峰形也發(fā)生了改變，在強酸性溶液中，化合物3主要以酸式形勢存在，整個化合物分子負電勢減弱，苝分子間發(fā)生聚集作用和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象使熒光萃滅。這說明化合物3的熒光強度與pH值間有著強烈的依賴關(guān)系，在強堿性溶液中熒光強度最強，在較寬的中性區(qū)域環(huán)境溶液中熒光較弱且穩(wěn)定，而在強酸性溶液中熒光被萃滅，此化合物可用作測定溶液pH值的熒光探針。

2.2 UV-vis吸收光譜

化合物3的最大吸收波長為534 nm。伴隨pH值減小，吸收峰強度減小。對于苝系衍生物來說，電子振動吸收具有自身的特點，υ=0→υ'=0,1和2的躍遷（這里的υ和υ'是基態(tài)和激發(fā)態(tài)的量子振動數(shù)）分別對應(yīng)著534 nm、500 nm和465 nm處吸收峰，當(dāng)單體開始聚集時，0→1和0→2躍遷會增加[9～10]，為利于比較0→1和0→2峰形變化，在534 nm處將峰值做歸一化處理（圖3）。從pH 10.75到9.66，0→1和0→2躍遷吸收有所增加，說明在這個pH范圍苝四羧酸根單體因發(fā)生π-π作用而聚集；從9.66到5.92，0→1和0→2躍遷吸收有微弱增加，說明在這個pH范圍的π-π聚集作用的大小變化較弱；而當(dāng)pH繼續(xù)降低到5.12甚至是更低的時候，0→1和0→0躍遷吸收的比率明顯的增大，初始的吸收峰發(fā)生紅移，最終在整個檢測波段內(nèi)出現(xiàn)吸收，這是因為伴隨pH值降低，化合物3的苝四羧酸單體發(fā)生π-π作用而聚集，從而阻止了光的通過，化合物3的紫外可見吸收光譜印證了熒光強度與pH值之間效應(yīng)的機理。

3 結(jié)論

合成了一種水溶性的熒光化合物：對稱苝二（天冬氨酸銨鹽）二酰亞胺化合物。研究了pH值變化對熒光光譜的影響，發(fā)現(xiàn)所研究化合物的熒光強度與pH值間有著強烈的依賴關(guān)系，在強堿性溶液中熒光強度最強，在較寬的中性區(qū)域環(huán)境溶液中熒光較弱，而在強酸性溶液中熒光被萃滅。這一結(jié)果對于深入研究苝二酰亞胺衍生物的基礎(chǔ)光物理性質(zhì)和pH熒光傳感體系的設(shè)計具有理論和應(yīng)用意義。

圖3 歸一化的10-5mol/L化合物3的水溶液的吸收光譜與pH值的對應(yīng)圖（pH：4.73，5.12，5.92，6.78，7.81，9.66，9.87，10.08，10.75）Fig.3 The normalized absorption spectra of compound 3(10-5mol/L)in water at different pH（pH：4.73，5.12，5.92，6.78，7.81，9.66，9.87，10.08，10.75）

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