檢測(cè)尿酸和葡萄糖電極式試紙條的研制

石平，李建平，方成，李玉平

（1.桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司，廣西桂林541001）（2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林541004）

0 引言

生物傳感器技術(shù)正被越來越多的應(yīng)用在臨床化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)的在線監(jiān)測(cè)等[1～2]。這種新的檢測(cè)手段和傳統(tǒng)的分析方法相比具有分離和檢測(cè)一體、響應(yīng)快、樣品用量少，成本低等特點(diǎn)。目前商業(yè)化的生物試紙條已超過十余種[3～7]，大致可分為光學(xué)型和電化學(xué)型兩大類，前者可視為傳統(tǒng)酶溶液比色法的衍生與移植，缺點(diǎn)是顯色后顏色分布不均并且易受環(huán)境光線與溫度影響[8]，電化學(xué)型生物試紙條可以視為同類光學(xué)型試紙條更新?lián)Q代產(chǎn)品，基本不受環(huán)境光線與溫度的影響，并且有更高的靈敏度與準(zhǔn)確度[9～12]。

鐵氰化鉀是一種無機(jī)電子媒介體，比一般有機(jī)電子媒介體穩(wěn)定，對(duì)pH的依賴性較小[13]，被廣泛使用于葡萄糖、肌胺酸、乳酸試紙條等商業(yè)化的電化學(xué)型生物試紙條中[14]。電子轉(zhuǎn)移與酶反應(yīng)同步，媒介體只起到酶與電極之間傳遞電子的橋梁作用[15～16]?；谠撛碓O(shè)計(jì)的酶試紙條通常由媒介體修飾的工作電極和固體參比電極(如Ag/AgCl電極)組成。這類試紙條的選擇性主要通過控制極化電位來實(shí)現(xiàn)，因而極易受樣品中易發(fā)生電極反應(yīng)的電活性物質(zhì)的干擾；而且電子傳遞的效率不高，試紙條的靈敏度不高；電子傳遞極易達(dá)飽和狀態(tài)，檢測(cè)濃度范圍很窄[17]。

該文使用絲網(wǎng)印制雙碳電極研究了溶液中鐵氰化鉀的伏安特性和安培響應(yīng)特性，設(shè)計(jì)出了以鐵氰化鉀為電子媒介體的葡萄糖和尿酸試紙條，并進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)測(cè)量在CHI660B電化學(xué)工作站(上海華辰儀器公司)上進(jìn)行。碳油墨ERC1(Ercon Inc.)通過絲網(wǎng)印刷在絕緣基底上，碳雙電極作為試紙條的工作電極和對(duì)電極，表觀電極面積1.0 mm×2.0 mm。葡萄糖氧化酶，100 U/mg，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；鐵氰化鉀K3[Fe(CN)6]、亞鐵氰化鉀K4[Fe(CN)6]購自上海試劑一廠。

溶液A：0.4 mol/L，準(zhǔn)確稱取6.585 0 g K3[Fe(CN)6]溶于50 mL二次蒸餾水，搖勻過夜；溶液B：0.4 mol/L，準(zhǔn)確稱取8.448 2 g K4[Fe(CN)6]·3H2O溶于50 mL二次蒸餾水，搖勻過夜；混合液C：將放置過夜的溶液A和溶液B以體積比1∶1混合搖勻。硼砂緩沖液pH=8.5：配制0.05 mol/L硼砂水溶液和0.1 mol/L磷酸氫二鉀水溶液，兩者體積比65∶35混合，搖勻。磷酸鹽緩沖液pH=7.0：配制0.2 mol/L Na2HPO4和0.2 mmol/L KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后體積比3∶7混合。尿酸溶液：稱取60 mg碳酸鋰，溶入15 mL二次蒸餾水中，室溫下溶解至飽和后用定性濾紙過濾，去渣，向?yàn)V液中加入3.362 2 g尿酸，50～60℃水浴至尿酸完全溶解，冷卻后用硼砂緩沖液稀釋至100 mL，得到0.2 mol/L的尿酸母液，4℃下保存?zhèn)溆?。葡萄糖溶液：稱取3.963 4 g D-葡萄糖(C6H12O6·H2O，198.17 g/mol)，分析純，廣東汕頭西隴化工廠，溶于磷酸鹽緩沖液中得0.2 mol/L葡萄糖溶液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渌噭┚鶠榉治黾?，試?yàn)用水為二次蒸餾水，試驗(yàn)溫度25℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵氰化鉀伏安性質(zhì)

分取5 mL溶液A、溶液B和混合液C放入3支10 mL比色管，各加入5 mL磷酸鹽緩沖液，搖勻，倒入10 mL電解杯中，設(shè)置掃描電位-0.6～0.6 V，掃描速度100 mV/s，分別測(cè)量溶液的伏安曲線。改變極化電壓，測(cè)定不同極化電壓下的電流強(qiáng)度。

用磷酸鹽緩沖液將溶液A和溶液B稀釋成0.2 mol/L，取5 mL 0.2 mol/L鐵氰化鉀溶液放入10 mL電解杯中，設(shè)置極化電壓0.4 V，加入0.2 mol/L亞鐵氰化鉀溶液并攪拌均勻，靜置片刻，記錄各次加入后的電流強(qiáng)度。

在保持鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的總濃度不變的情況下，測(cè)定鐵氰化鉀溶液隨亞鐵氰化鉀濃度變化下的電流強(qiáng)度變化。

1.2.2 尿酸，葡萄糖試條制備

將相關(guān)試劑按照一定的配比制成反應(yīng)液，用微量取液器在印制電極的各電極片上滴加反應(yīng)液0.5 μL，室溫下干燥后，加蓋微池體，試紙條結(jié)構(gòu)如圖1。其中葡萄糖試紙條反應(yīng)液由葡萄糖氧化酶、鐵氰化鉀和羧甲基纖維素鈉組成，尿酸試紙條反應(yīng)液由鐵氰化鉀和羧甲基纖維素鈉組成。

圖1 尿酸和葡萄糖試紙條結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Uric acid or Glucose strip(a)接頭(contact)；(b)工作電極(work electrode)；(c)對(duì)電極(counter electrode)；(d)試劑斑(reagent spot)；(e)微池(micro-pool)；(f)基底(substrate)

1.2.3 尿酸和葡萄糖測(cè)定

取2.5 mL鐵氰化鉀溶液6份放入10 mL比色管中，分別加入0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL尿酸溶液，然后用硼砂緩沖液定容至5 mL。設(shè)置極化電壓0.4 V，測(cè)定電流強(qiáng)度曲線。同上取鐵氰化鉀溶液，各加入1U固體粉狀葡萄糖氧化酶，分別加入0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL葡萄糖溶液，然后用磷酸鹽緩沖液定容至5 mL，測(cè)定電流強(qiáng)度。

尿酸或葡萄糖試紙條測(cè)試時(shí)，取3 μL尿酸或葡萄糖試液滴加在試紙條的微池中，在工作電極與對(duì)電極之間加400 mV電壓，測(cè)試電極的反應(yīng)電流強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵氰化鉀伏安特性

圖2 鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀及其混合液的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammetric curves of the solutions of potassium ferricyanide,potassium ferrocyanide and their mixture

相同濃度下，鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀和混合液的伏安曲線如圖2。可以發(fā)現(xiàn)三者均有雙峰，且曲線關(guān)于零點(diǎn)中心對(duì)稱。任何導(dǎo)電性表面在接觸含氧化還原性物質(zhì)的溶液時(shí)，導(dǎo)電表面會(huì)產(chǎn)生凈電荷。溶液中的氧化性和還原性物種均對(duì)導(dǎo)電性物質(zhì)充電，從而產(chǎn)生極化電位，其大小由溶液中Red/Ox的濃度比決定。又因?yàn)閮呻姌O性狀幾乎完全相同，因此兩電極的極化電位應(yīng)該相同，即鐵氰化鉀的電解電壓為0 V。當(dāng)在雙電極上外加電壓時(shí)，外加電壓應(yīng)該平均分配在2個(gè)電極上，如外加電壓0.5 V時(shí)，則一電極升高0.25 V，而另一電極會(huì)下降0.25 V。對(duì)于鐵氰化鉀溶液來說，[Fe(CN)6]3-總選擇在電位降低的電極上被還原，因此[Fe(CN)6]3-發(fā)生還原反應(yīng)的場(chǎng)所會(huì)隨外加電壓方向改變而改變，導(dǎo)致伏安曲線呈中心對(duì)稱。

相同濃度下亞鐵氰化鉀的響應(yīng)值是鐵氰化鉀的1/8左右，差異源于電極反應(yīng)速度常數(shù)（kred，kox）不同。kred=k0exp[-αF/RT(E-E0)]，kox=k0exp[(1-α)F/RT(E-E0)]。

式中k0表示電對(duì)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)常數(shù)，α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，E0為標(biāo)準(zhǔn)電極電位，R是摩爾氣體常數(shù)，T是絕對(duì)溫度。因?yàn)殍F氰化鉀和亞鐵氰化鉀具有相同的k0、α、E0，擴(kuò)散系數(shù)D也近似相同，可見電極反應(yīng)速度常數(shù)隨電位差|E-E0|增大而增大。

分別測(cè)定了0.2 mol/L鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀與亞鐵氰化鉀的混合液，在不同極化電壓下的電流強(qiáng)度。從圖3可以發(fā)現(xiàn)電流強(qiáng)度隨極化電壓增大而增大，對(duì)0.2 mol/L鐵氰化鉀或亞鐵氰化鉀來說，增速不大，但對(duì)0.2 mol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀的混合液卻表現(xiàn)極其明顯。從曲線的對(duì)稱形狀可以預(yù)見極化電壓的大小和正負(fù)均不會(huì)影響電流強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系，電壓的大小只改變電流響應(yīng)靈敏度，因此以鐵氰化鉀為電子媒介時(shí)，可根據(jù)檢測(cè)物濃度和干擾情況，檢測(cè)電壓可以在-0.6～0.6 V范圍內(nèi)任意選定。為了便于試驗(yàn)對(duì)比和滿足一定的靈敏度要求，試驗(yàn)中統(tǒng)一采用極化電壓0.4 V。

圖3 不同電位下的安培響應(yīng)曲線Fig.3 Plot of amperometric response vs.measurement potential

2.2 鐵氰化鉀的電子媒介作用

如圖4所示，在曲線的下段呈的線性關(guān)系，即當(dāng)鐵氰化鉀轉(zhuǎn)化為亞鐵氰化鉀的比率≤25%時(shí)，電流強(qiáng)度與生成的亞鐵氰化鉀的量成線性關(guān)系。因此可以認(rèn)為鐵氰化鉀的電子媒介作用是通過其轉(zhuǎn)化成亞鐵氰化鉀來實(shí)現(xiàn)的，所以任何可導(dǎo)致上述轉(zhuǎn)化發(fā)生的物質(zhì)都可以借助鐵氰化鉀為電子媒介來測(cè)定。

圖4 亞鐵氰化鉀濃度與電流強(qiáng)度變化曲線（虛線表示在曲線的下段呈的線性關(guān)系）Fig.4 Plot of amperometric response vs.concentration of potassium ferrocyanide

由于在pH=8.5時(shí)尿酸能與鐵氰化鉀反應(yīng)，定量生成亞鐵氰化鉀；pH=7.0時(shí)葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化下與鐵氰化鉀反應(yīng)，定量生成亞鐵氰化鉀，電流強(qiáng)度見圖5。與圖4對(duì)比，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)趨勢(shì)極其相似，從而應(yīng)證前面的原理。

圖5 尿酸，葡萄糖濃度與電流強(qiáng)度值變化曲線Fig.5 Plot of amperometric response vs.concentration of uric acid or glucose

2.3 尿酸和葡萄糖試紙條測(cè)試性能

為檢測(cè)尿酸和葡萄糖試紙條的臨床使用效果，取35例病人血液樣品，使用尿酸和葡萄糖試紙條測(cè)試樣品中尿酸和葡萄糖的含量，并將測(cè)試結(jié)果與醫(yī)院生化分析常規(guī)方法的測(cè)試結(jié)果對(duì)比。常規(guī)方法中，尿酸測(cè)試為磷鎢酸還原法，葡萄糖測(cè)試為鄰甲苯胺法（o-Toluidin，O-TB），樣品測(cè)定結(jié)果對(duì)照見圖6。兩種方法間均有較好的相關(guān)性（y=0.995x+2.317 5，r=0.987 6；y=0.981x+0.032 7，r=0.983 1）。

圖6 尿酸（a）和葡萄糖（b）試紙條與常規(guī)方法測(cè)試結(jié)果比對(duì)Fig.6 Result of comparing conventional method with uric acid(a)or glucose strip(b)

樣品測(cè)定結(jié)果與醫(yī)院生化分析結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析兩組間比較用配對(duì)T檢驗(yàn)，尿酸檢驗(yàn)結(jié)果t為-0.804,雙側(cè)檢驗(yàn)的概率P為0.427；葡萄糖檢驗(yàn)結(jié)果t為1.814,雙側(cè)檢驗(yàn)的概率P為0.079；可見，尿酸和葡萄糖試條檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法測(cè)定結(jié)果，其差別在統(tǒng)計(jì)上無顯著性意義。

2.4 臨床檢測(cè)

為檢測(cè)尿酸和葡萄糖試紙條的使用效果，取35份臨床血清樣品，使用尿酸和葡萄糖試紙條測(cè)試樣品中尿酸和葡萄糖的含量，并將測(cè)試結(jié)果與醫(yī)院常規(guī)全自動(dòng)生化分析儀的測(cè)試結(jié)果（酶反應(yīng)-光度法）對(duì)比。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將自制試紙條測(cè)定結(jié)果與常規(guī)生化檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行直線線性相關(guān)性分析比較，兩組間比較用配對(duì)T檢驗(yàn)（Paired-samples T Test），若P＞0.05，則認(rèn)為沒有顯著差異。

3 結(jié)論

該文使用印制雙碳電極研究了鐵氰化鉀電子媒介體的伏安性質(zhì)，提出了鐵氰化鉀的電子媒介作用的新模式：鐵氰化鉀的電子媒介作用可以通過其轉(zhuǎn)化成亞鐵氰化鉀來實(shí)現(xiàn)，任何可導(dǎo)致上述轉(zhuǎn)化發(fā)生的物質(zhì)都可以借助鐵氰化鉀為電子媒介來測(cè)定，合理使用媒介體可以達(dá)到檢測(cè)非電活性物質(zhì)或放大檢測(cè)信號(hào)等目的。設(shè)計(jì)了性能優(yōu)越的尿酸、葡萄糖試紙條。利用試條對(duì)病人血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果與醫(yī)院生化分析常規(guī)方法的測(cè)試結(jié)果一致。該試條電子傳遞的效率高，試條制作過程簡單。對(duì)于臨床血糖和尿酸的臨床檢驗(yàn)有重要意義。

[1]Wang J.Electrochemical glucose biosensors[J].Chem.Rev.,2008,108:814～825.

[2]Alcock S J.Technology for continuous invasive monitoring of glucose[A].Proc IEEE Eng.Med.Biol.,18th Ann Int Conf of the IEEE Amsterdam,1996,838:1～3.

[3]McAleer J F,Scott D,Hall G,et al.Disposable glucose test strips,and methods and compositions for making same[P].US Patent,5708247,1998-01-13.

[4]Yamamoto T,Yoshioka T,Nankai S.Cholesterol sensor and method for producing the same[P].US Patent,6117289,2000-09-12.

[5]Schou C,Schulein M,Vollmond T.Cellobiose oxidase,and enzymatic agent and a process for treating paper pulp[P].US Patent,5866392,1999-02-02.

[6]Anaokar S G,Antonopoulos G L,Cunningham P.Test Strip for determining concentration of triglycerides[P].US patent,7214504,2007-05-08.

[7]Nishidate K,Suzuki Y,Inaba S.Method of determining glucose-6-phosphate and composition therefore[P].US Patent,5492815,1996-02-20.

[8]Brahim S,Narinesingh D,Guiseppi-Elie A.Amperometricdeterminationof cholesterol in serum using a biosensor of cholesterol oxidase contained within a Polypyrrole-hydrogel membrane[J].Anal.Chim.Acta,2001,448:27～36.

[9]Singh A K,Flounders A W,Volponi J V,et al.Development of sensors for direct detection of organo-phosphates.Part I:immobilization,characterizationand stabilization of acetylcholinesterase and organophosphate hydrolase on silica supports[J].Biosens.Bioelectron.,1999,14:703～713.

[10]Chen Z,Fang C,Qiu G,et al.Non-enzymatic disposable test strip for detecting uric acid in whole blood[J].J.Electroanal.Chem.,2009,633:314～318.

[11]Li J P,Wei X P,Yuan Y H.Synthesis of magnetic nanoparticles composed by Prussian blue and glucose oxidase for preparing highly sensitive and selective glucose biosensor[J].Sens.Actuat.:B.Chem.,2009,139:400～406.

[12]Li J P,Liu R,Pan H C,et al.Preparing of hybrid bio-organic-inorganic composite membrane for amperometric mediatorless glucose micro biosensor[J].Sensor Lett.,2009,7(4):557～562.

[13]Li J P,Zhao J,Wei X P.A sensitive and selective sensor for dopamine determination based on a molecularly imprinted electropolymer of o-aminophenol[J].Sens.Actuat.:B.Chem.,2009,140:663～669.

[14]Taniguchi I,Miyamoto S,Tomimura S,et al.Mediated electron transfer of lactate oxidase and sarcosine oxidase with octacyanotungstate(Ⅳ)and octacyanomolybdate(Ⅳ)[J].J.Electroanal.Chem,1988,240:333～339.

[15]Bartlett P N,Tebbutt P,Whitaker R G.Kinetic aspects of the use of modified electrodes and mediators in bioelectrochemistry[J].Prog.Reaction Kinetics,1991,16:55～155.

[16]Li J P,Yu J G.Fabrication of Prussian Blue modified ultramicroelectrode for GOD imaging using scanning electrochemical microscopy[J].Bioelectrochemistry,2008,72(1):102～106.

[17]Buck R P,Bowden E F,Umatia M,et al.Biosensor Technology:Fundamentals and Applications[M].Marcel Dekker,New York,1990,pp3.