miRNA檢測技術進展

周殿明,蔣健暉

（化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南大學化學化工學院，湖南長沙410082)

0 引言

RNA是除了DNA外的基因分子生物學的又一龐大家族，miRNA就是這個家族中的一個非常重要的成員。1993年，Lee等在線蟲（C.elegans）發(fā)現(xiàn)了第一個定時調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4[1]，也就是第一個miRNA；同時發(fā)現(xiàn)它不編碼任何蛋白質(zhì)，但是可以抑制Lin-14蛋白表達,然而當時的這個發(fā)現(xiàn)并未引起太多的關注。直到2000年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個miRNA-let-7[2]，miRNA這一非編碼基因家族的重要成員才開始在人們的眼前逐漸清晰起來。

miRNA是一類約22個堿基左右的非編碼蛋白的RNA，通常在18～25個堿基之間，成熟的miRNA 5'端有一個磷酸基團，3'端是羥基。它主要通過信使RNA的直接剪切，或者間接抑制翻譯來實現(xiàn)基因調(diào)控作用。miRNA廣泛存在于各種真核生物中，它在生物體的產(chǎn)生過程如圖1所示。

首先攜帶miRNA信息的基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成較長的RNA,也就是通常所說的pri-miRNA，然后pri-miRNA會被一種叫做Drosha的RNA內(nèi)切酶Ⅲ剪切成60～70個堿基的含有莖環(huán)結(jié)構的RNA,即pre-miRNA。隨后，premiRNA被載體蛋白Exportin-5從細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)中。到了細胞質(zhì)以后，pre-miRNA會從載體蛋白中脫落下來，被一種叫做Dicer的RNA內(nèi)切酶Ⅲ最終剪切成成熟的miRNA。此時的miRNA是雙鏈的結(jié)構，其中5'端熱穩(wěn)定性較差的一條鏈將被特異性地整合到RNA誘導的沉默復合物(RISC)中，再與完全匹配的目標信使RNA結(jié)合，或者通過誘導miRNA的降解，或者通過間接調(diào)節(jié)翻譯，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的調(diào)控功能。

圖1 miRNA在細胞內(nèi)的產(chǎn)生過程及調(diào)控原理圖Fig.1 Schematic of miRNA production and regulation in cell

從上面可以看出，miRNA由于其特殊的調(diào)控功能，不僅對生物的生長、發(fā)育和凋亡有著重要的影響，而且還與各種疾病比如神經(jīng)疾病、血管疾病、腫瘤和免疫方面[3～5]的疾病有著密切的關系。因此miRNA的檢測，對于醫(yī)學、分子生物學都有著非常重要的意義。近年來已有大量的文章涉及了這方面的工作，該文就是基于此對于目前世界上各個研究小組關于miRNA檢測方法的研究進展做了一個簡要的綜述。

1 基于表面雜交的檢測技術

1.1 印跡雜交技術

印跡雜交技術（即nothern blotting）是最常用也是最早用于miRNA檢測的方法[6～9]，主要原理是將標記的與目標miRNA互補的DNA探針雜交到硝酸纖維素膜上，然后顯影檢測。該方法雖然已成為miRNA檢測的金標準，但是仍然存在很多問題，比如靈敏度低，費時等。Zolta′n Havelda小組于2004年將通過引入鎖核酸（LNA）對該方法進行了改進[10]，由于雜交效率得到改善，所以靈敏度提高了大約10倍。雖然如此，高靈敏度，高通量，特異性好的檢測技術仍然是個挑戰(zhàn)。

1.2 陣列平臺檢測技術

miRNA的陣列檢測技術主要是構建含有與目標miRNA互補的DNA的陣列，然后與目標雜交，再通過各種各樣的信號檢測方法實現(xiàn)檢測目的。最常用的是通過聚合酶延伸的方法產(chǎn)生信號。2004年，Nelson等發(fā)展了一種名為基于陣列RNA引物介導的Klenow酶反應（RAKE）的檢測技術[11](圖2)，該技術將DNA探針的5'端固定于玻璃表面，探針的3'端是與目標miRNA互補的序列，緊挨著互補序列的是三個胸腺嘧啶核苷酸殘基，因此當目標存在時，將被探針捕獲到基底表面，單鏈的探針可以通過外切酶I切除，此時加入生物素化的dATP和Klenow聚合酶可以延伸出生物素化的腺嘌呤堿基，再與染料標記的親和素結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。另外,依賴于Poly(A)聚合酶的延伸方法也被引入到miRNA的檢測，Shingara等[12](圖3)利用Poly(A)聚合酶以RNA為引物延伸出氨基修飾的尿嘧啶核苷酸，再利用染料與氨基修飾的尿嘧啶核苷酸交聯(lián)，獲得熒光檢測信號。2006年，F(xiàn)ang等[13]同樣用Poly(A)聚合酶的延伸方法實現(xiàn)miRNA的檢測，不同的是延伸出的Poly(A)通過與Poly(T)修飾的納米金粒子結(jié)合做為信號獲得方式。

Liang等[14](圖4)采用了對miRNA直接修飾的方法實現(xiàn)對其檢測，將miRNA的3'端直接生物素修飾，然后再與親和素化的量子點結(jié)合，從而得到熒光信號。該陣列的檢測限可以達到0.4 fmol,檢測的動力學范圍為兩個數(shù)量級。

圖2 基于陣列RNA引物介導的Klenow酶反應（RAKE）的檢測技術原理圖（RNA-primed,array-based Klenow enzyme(RAKE)assay）Fig.2 Schematic of RNA-primed,array-based Klenow enzyme assay(RAKE)

圖3 基于Poly(A)聚合酶延伸修飾堿基U的miRNA陣列檢測Fig.3 Schematic of miRNA microarray detection based on extension modified nucleotides U by Poly(A)

圖4 生物素化的miRNA通過量子點進行陣列檢測原理圖Fig.4 Schematic of biotin modified miRNA profiling microarray detected with QD

DNA/RNA雜交體的特異性抗體被以一種新的標記方式引入到miRNA的檢測中來，Hu等[15]構建了一個傳感陣列，直接將未標記的目標miRNA與固定的DNA探針雜交，然后加入不依賴于序列信息的抗DNA/RNA雜交體的單克隆抗體，該抗體與染料標記的二抗結(jié)合，或者與生物素標記二抗和染料標記的親和素反應，都可以得到檢測信號。

除了上述的陣列檢測平臺以外，還有很多這方面的報道，比如利用生物發(fā)光酶標記的miRNA與待測miRNA競爭雜交到固定化的DNA探針上[16]，通過檢測生物發(fā)光強度實現(xiàn)目標檢測的方法等等[17～20]。

1.3 電化學檢測技術

硅納米線[21]（SiNWs）以其優(yōu)越的性能被廣泛應用于化學生物傳感器，將肽核酸固定在其表面上可以作為檢測miRNA的探針，當與檢測對象miRNA進行雜交時，將會引起SiNWs界面電阻的變化，其變化值與miRNA濃度相關.該技術無需標記，檢測miRNA濃度的下限可達1 fmol/L，具有良好的特異性。Lusi等[22](圖5)發(fā)展了另一種無標記電化學檢測技術，將用次黃嘌呤修飾的不含鳥嘌呤的DNA做為固定探針，目標miRNA存在時可以直接檢測目標中鳥嘌呤的電化學信號，實現(xiàn)miRNA的檢測。此外，F(xiàn)an等[23]利用目標介導在納米間隙電極上沉積導電聚合物納米線的方法進行miRNA的檢測。該方法首先將肽核酸固定于電極間隙中，與完全互補的目標鏈雜交以后，由于肽核酸不含電荷，而目標呈負電性，可以通過靜電作用結(jié)合帶有正電的苯胺，在酶催化的條件下，形成導電的聚苯胺納米線，電極的導電性與目標物的含量成比例。該傳感裝置可以檢測低至5 fmol/L的miRNA。除了無標記電化學的檢測技術外，還可以通過目標miRNA直接修飾具有電化學催化活性的物質(zhì)，比如氧化鋨納米粒子[24]和Ru(PD)2Cl2[25]，這些電化學催化物質(zhì)都可以催化肼的氧化反應，產(chǎn)生電化學信號，從而達到檢測miRNA的目的。

圖5 電化學檢測次黃嘌呤修飾的捕獲探針與目標miRNA雜交Fig.5 Electrochemical detection of the hybridization between the Inosine-modified capture probe and target miRNA

2 均相miRNA檢測技術

2.1 基于PCR信號放大的檢測技術

圖6 基于莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的實時定量PCR技術（stem-loop RT-PCR）Fig.6 Real-time PCR based on stem-loop RT primer

PCR，即聚合酶鏈式反應，是一種DNA的指數(shù)擴增技術。美國科學家Mulis因發(fā)明了該技術獲得了1995年諾貝爾化學獎。PCR技術通過兩個短的稱為引物（primer）的DNA分子，大約20個堿基左右，在一種耐熱的DNA聚合酶的作用，可以在較短的時間內(nèi)把極少的DNA量提高千萬倍之多。PCR技術對分子生物學研究起到了巨大的推動作用，而且隨著PCR技術的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應用也越來越廣泛。2005年，Chen等[26](圖6)將反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術引入到miRNA的檢測當中，建立了名為莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術（stem-loop RT-PCR）。他首先設計了一個莖環(huán)結(jié)構的反轉(zhuǎn)錄的探針，據(jù)報道這種結(jié)構大大提高了反轉(zhuǎn)錄的效率和特異性。當目標miRNA存在時，該探針與其雜交進行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再加入正反引物和Taqman探針，進行定量PCR。該方法可以檢測總RNA中低至25 pg的miRNA，實際上，高的靈敏度和特異性可以使該方法用于單個細胞的miRNA檢測而不需要核酸純化。該方法有很強的實用性，可以用于各種miRNA檢測[27]。與此類似的，Raymond等[28]用一個普通的基因特異性線性探針進行雜交反轉(zhuǎn)錄，然后利用一個短的序列與被測物相關含有鎖核酸的引物，和另一個通用的引物進行PCR反應，在一定程度上也可以提高特異性。與上面兩種反轉(zhuǎn)錄PCR技術不同，Soroush及其研究團隊[29]首先用一個含有六個堿基和目標互補的探針與miRNA雜交，該探針同時含有5'端多余的堿基，進行反轉(zhuǎn)錄后，產(chǎn)生含有5'端突出cDNA，此時加入同樣5'端突出的與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生部分序列互補的探針，該探針與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交相互為模板延伸，這樣就相當于在miRNA的兩測引入了通用序列，可以用通用引物擴增。該技術檢測的動力學范圍可達6～8個數(shù)量級，下限可達0.2 fmol/L。不過這些方法都是通過探針與目標miRNA直接雜交進行反轉(zhuǎn)錄的，由于miRNA序列短，所以需要用各種辦法來提高雜交效率，但是有一種檢測技術可以避免這個問題[30]，通過Poly(A)聚合酶延伸miRNA產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合序列Poly(A)，進行反轉(zhuǎn)錄，然后用同樣的兩個引物，一個是通用的，一個是miRNA特異的進行定量PCR擴增。2009年，Li等[31](圖7)建立一種不依賴反轉(zhuǎn)錄的PCR檢測技術，該技術設計了兩個探針，分別由兩部分組成，一部分可以與目標miRNA完全互補，另一部分是引物結(jié)合序列。這樣，兩個探針在與miRNA互補配對后，由連接酶連接成一條完整的定量PCR模板，加入上下游引物，則可以進行定量PCR反應。

圖7 基于酶連接實時PCR用于檢測miRNAFig.7 Real-time PCR assay for detection of miRNA based on enzymatic ligation

2.2 基于RCA的檢測技術

滾環(huán)擴增技術（Rolling Circle Amplification）也叫滾環(huán)復制技術，是一種等溫擴增方法，它以環(huán)狀DNA為模板，在引物存在時，聚合酶將連續(xù)復制出無數(shù)個環(huán)的互補序列拷貝。該技術已經(jīng)成為生物分析領域的核心技術，得到了廣泛的應用。2006年，Jonstrup等[32]將RCA技術用于miRNA的檢測，miRNA首先做為模板將探針連成環(huán)，同時做為引物在聚合酶的作用下延伸聚合放大。Cheng等[33]在此基礎上發(fā)展了miRNA檢測的分支滾環(huán)擴增技術（branched rolling-circle amplification）。仍舊以miRNA為模板和引物，不同的是，引入了第二個引物，序列與環(huán)的一部分相同，可以與滾環(huán)產(chǎn)物雜交并延伸擴增，再通過聚合酶的鏈置換活性不僅可以擴增出環(huán)互補序列的無數(shù)個拷貝，還可以在引物2的作用下延伸出和環(huán)相同序列的無數(shù)個拷貝。最后通過染料嵌入實現(xiàn)信號檢測。與前兩種方法不同的是，Yao等[34]首先將引物與目標雜交進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物將以另一個橋探針為模板，連成環(huán)狀分子。再加入引物1進行滾環(huán)擴增，加入引物2進行分支擴增。每次反應體系可以檢測103～1010個拷貝的miRNA，動力學范圍很寬，而且可以區(qū)分單堿基錯配和區(qū)分成熟的miRNA及其前體(圖8)。

2.3 其它均相檢測技術

除了基于PCR和RCA為基礎的檢測技術外，還有很多均相檢測技術，比如連接酶鏈式反應[35]，陽離子聚合物[36]，invader反應[37]，基于核酶的信號放大檢測技術[38]，同位素標記連接技術[39]，和將反轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄結(jié)合的信號檢測技術等等[40]。

圖8 基于RCA的miRNA檢測技術（A[32],B[33],C[34]）Fig.8 miRNA detection based on RCA

3 結(jié)論

綜上所述，miRNA做為一種重要的基因表達調(diào)控手段，參與各種生物活動，和控制多種疾病的發(fā)生發(fā)展。其檢測手段也越來越受到人們的重視，各種各樣的檢測技術已被運用到miRNA的檢測之中，但是無論是界面檢測技術還是均相檢測技術，存在自身優(yōu)點的同時都或多或少存在不足，獲得高靈敏度，高通量，高選擇性，高特異性的檢測技術仍然需要生物分析專業(yè)研究者的進一步努力。

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