毛竹葉多糖對(duì)高脂血癥小鼠的降脂利肝作用

丁紅秀，高蔭榆*，晁紅娟，夏冬華

(1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；2. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

毛竹葉多糖對(duì)高脂血癥小鼠的降脂利肝作用

丁紅秀1,2，高蔭榆2,*，晁紅娟2，夏冬華2

(1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；2. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

研究毛竹葉多糖的降血脂、肝脂及促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用。以正常小鼠作空白對(duì)照，將高脂血癥脂肪肝模型小鼠分為高脂模型組、毛竹葉多糖低、中、高劑量組和血脂康陽(yáng)性藥物對(duì)照組，進(jìn)行不同灌胃處理，測(cè)定小鼠血脂、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肝粗脂肪含量、肝指數(shù)及肝組織細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果表明：毛竹葉多糖可顯著降低小鼠血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)；對(duì)血清高密度脂蛋白(HDL)影響不明顯；可顯著降低肝粗脂肪含量，改善小鼠的肝功能。

毛竹葉多糖；高血脂；脂肪肝；降血脂；肝功能

血脂高于正常值上限稱為高脂血癥，目前認(rèn)為高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生密切相關(guān)，總膽固醇(TC)或低密度脂蛋白(LDL)過(guò)高是AS的主要危險(xiǎn)因素，而高甘油三酯(TG)或血清高密度脂蛋白(HDL)濃度過(guò)低也被認(rèn)為是AS的危險(xiǎn)因素[1]。AS是導(dǎo)致人類心腦血管疾病的元兇，對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大的危害。因此有效控制高脂血癥的發(fā)生，可以減少心腦血管疾病。臨床上常采用貝特類藥和他汀類藥預(yù)防和治療高脂血癥，效果不錯(cuò)，但難免有副作用[2]。因此尋找效果顯著、安全可靠的降血脂藥一直是人們長(zhǎng)期研究的課題[3]。

肝臟是人體重要的代謝器官，對(duì)糖、脂類及蛋白質(zhì)代謝起主要作用。食物中的甘油三酯由消化管吸收，在肝細(xì)胞內(nèi)同化后經(jīng)血液運(yùn)輸至脂肪組織中貯存，當(dāng)肝功能障礙或肝臟損傷時(shí)，進(jìn)入肝臟的脂肪運(yùn)出受阻，大量積存于肝細(xì)胞內(nèi)而形成脂肪肝[4]，引起肝細(xì)胞腫大、脂肪浸潤(rùn)性炎癥壞死等肝損傷和功能異常。肝損傷及功能衰竭時(shí)，血清TG低于正常，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性會(huì)急劇升高。

植物多糖為天然產(chǎn)物，無(wú)毒副作用，研究表明一些植物多糖及真菌多糖具有明顯降血脂、肝脂及促進(jìn)肝損傷恢復(fù)的作用[5-12]，毛竹葉含有豐富的活性多糖成分[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)昆明小白鼠，成功建立高血

脂、脂肪肝合并肝損傷模型小鼠，以低、中、高3個(gè)不同劑量毛竹葉多糖(polysaccharide from moso bamboo leaves，PMBL)為受試物，對(duì)照正常小鼠、病態(tài)模型小鼠及血脂康治療小鼠，通過(guò)檢測(cè)血清TG、TCHO、HDL、LDL含量；血清ALT活性；肝粗脂肪含量及肝組織形態(tài)變化等，研究PMBL對(duì)高血脂、脂肪肝合并肝損傷小鼠的降脂利肝功效，以期為PMBL的藥物應(yīng)用可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹葉多糖 本實(shí)驗(yàn)室制備；普通飼料 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

豬油(豬板油) 市售；膽固醇、牛膽鹽(生化試劑)天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙基硫氧嘧啶 上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司；血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司；ALT體外診斷測(cè)試盒 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；TG、TCHO體外診斷試劑 溫州津瑪生物科技有限公司；HDL、LDL體外診斷試劑 日本協(xié)和メヴツヶス株式會(huì)。

高脂飼料參考文獻(xiàn)[15-17]，設(shè)計(jì)成分為：膽固醇1%、牛膽鹽0.3%、丙基硫氧嘧啶0.2%、豬油10%、普通飼料88.7%。配制方法：豬油加熱融化后加入膽固醇、牛膽鹽和丙基硫氧嘧啶粉末，充分混勻后趁熱倒入普通飼料，迅速用手揉搓拌勻，55℃烘干備用。

1.2 儀器與設(shè)備

DTQ-100多功能提取器 湖南省衡陽(yáng)市東泰醫(yī)藥機(jī)械制造有限公司；組合膜分離裝置 湖州科濾膜技術(shù)有限公司； SP-1910UVPC紫外掃描分析儀 上海光譜儀器有限公司； 7600-020自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司；3k15臺(tái)式高速冰凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；6010-紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 安捷倫中國(guó)上海分公司； A1604電子天平 上海天平儀器廠；101-2型恒溫干燥箱 上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西分析儀器廠；HH-SH-4型電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠； RM2135石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica公司；顯微攝影操作系統(tǒng) 日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠，全雄性，體質(zhì)量(18±2)g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)02196-02。

1.4 方法

1.4.1 毛竹葉多糖的制備及定性測(cè)定

利用DTQ-100多功能提取器于加熱80℃、真空沸騰提取毛竹葉多糖，毛竹葉單次用量為2000g，固液比為1∶30，提取時(shí)間2h，提取兩次，合并提取液并進(jìn)行濃縮，通過(guò)組合分離膜裝置分級(jí)截流純化得納濾回流液(截留物分子質(zhì)量范圍：1000～6000D)和超濾回流液(截留物分子質(zhì)量＞6000D)。合并濃縮回流液，活性炭脫色干燥得精制毛竹葉多糖。將所得到的PMBL配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的溶液即可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

多糖的鑒別反應(yīng)，苯酚-硫酸反應(yīng)：糖定性反應(yīng)；碘-碘化鉀反應(yīng)：淀粉定性；雙縮脲反應(yīng)：蛋白質(zhì)鑒定；三氯化鐵反應(yīng)：多酚類物質(zhì)鑒定；斐林試劑反應(yīng)：還原糖測(cè)定；硫酸-咔唑反應(yīng)：糖醛酸鑒定；氯化鋇明膠比色法：硫酸基鑒定及含量測(cè)定。

多糖純度測(cè)定采用硫酸-蒽酮法，具體操作如下 ：

將一定量的精制毛竹葉多糖用蒸餾水復(fù)溶，測(cè)定其多糖含量，再按下列公式計(jì)算粗多糖純度。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及喂養(yǎng)

雄性昆明小鼠80只在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下預(yù)飼數(shù)天。隨機(jī)取20只作正常對(duì)照(正常對(duì)照I組和正常對(duì)照II組)，喂于普通飼料；其余60只作實(shí)驗(yàn)組喂于高脂飼料兩周后，隨機(jī)分為6組，每組10只。隨機(jī)取1組(模型組)與正常對(duì)照組10只(正常對(duì)照I組)一起眼眶取血測(cè)定相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行肝組織病理切片檢查，以檢測(cè)建模成功與否。正常對(duì)照II組和其余5個(gè)實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)喂給普通飼料，并分別進(jìn)行灌胃處理。

正常對(duì)照II組(NG)和高脂對(duì)照組(HL)，灌胃0.9%生理鹽水；陽(yáng)性藥物治療組(PC)，灌胃血脂康400 (mg/(kg bw·d))；低PMBL組(LPMBL)，灌胃200 (mg/(kg bw·d))PMBL；中PMBL組(MPMBL)，灌胃400(mg/(kg bw·d))PMBL；高PMBL組(HPMBL)，灌胃600(mg/(kg bw· d))PMBL；每天上午9：00灌胃給藥，給藥容積為0.2mL/(10g bw·d)。連續(xù)兩周，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和攝食。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)材料取樣及檢測(cè)方法

末次灌胃前一天晚上停食，末次灌胃1h后稱質(zhì)量并眼眶取血。血樣于4℃，6000r/min離心20min分離血清后上機(jī)測(cè)定TG、TCHO、HDL、LDL及ALT各項(xiàng)指標(biāo)值。同時(shí)解剖取肝臟稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)，并取樣進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查，肝臟組織病理學(xué)檢查采用常規(guī)石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察的方法。剩余肝臟于50℃恒溫干燥至質(zhì)量恒定后采用索式提取法測(cè)定肝臟粗脂肪含量。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMBL定性及純度測(cè)定結(jié)果

通過(guò)各項(xiàng)定性反應(yīng)結(jié)果顯示，PMBL的苯酚-硫酸反應(yīng)為陽(yáng)性；碘-碘化鉀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)均為陰性；氯化鋇明膠比濁反應(yīng)為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)表明PMBL可能含有硫酸基，為不含糖醛酸、酚類、氨基酸或蛋白質(zhì)的非淀粉類可溶的酸性多糖。純度測(cè)定結(jié)果表明，精制的毛竹葉多糖的純度為41.07%。

2.2 造模結(jié)果

表1 高脂飼料模型小鼠的血脂變化Table 1 Change of serum lipid in model mice with hyperlipidemia

表2 高脂飼料模型小鼠ALT、肝系數(shù)、肝粗脂肪含量變化Table 2 Change of ALT, liver index and crude fat content in liver of model mice with hyperlipidemia

圖1 高脂飼料模型小鼠肝組織形態(tài)變化(HE染色)Fig.1 Histopathological change of liver tissue in model mice with hyperlipidemia

表3 PMBL對(duì)小鼠血清TG、TCHO、LDL和HDL含量的影響Table 3 Effect of PMBL on serum TG, TCHO, LDL and HDL in mice

通過(guò)造模，高脂飼料造模組小鼠與正常對(duì)照I組血脂含量及肝臟差異見(jiàn)表1、2和圖1。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨高脂飼料飼養(yǎng)時(shí)間的推移，高脂造模組小鼠精神逐漸萎靡，毛發(fā)明顯變得凌亂糾結(jié)，食欲不佳且反應(yīng)遲鈍，糞便溏浠，體質(zhì)量也出現(xiàn)一定差異。表1血脂測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)兩周后，模型組小鼠的TCHO、LDL含量分別比正常對(duì)照組高出2倍多和10多倍，而TG則比正常對(duì)照組低近一半，呈極顯著差異。表2肝臟指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，模型組ALT活力值比正常對(duì)照組高出近4倍，肝系數(shù)超出正常近3成，肝粗脂肪含量均比正常對(duì)照組高出近4倍，均具極顯著差異。由圖1肝病理組織切片可以看出，與正常對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的彌漫性肝脂變和炎性變，以肝小葉周邊最為嚴(yán)重。脂變肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散雜亂、膨大變形，細(xì)胞漿被大量的脂肪侵占導(dǎo)致染色不均或出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)呈完全空泡狀，由于脂肪的擠壓導(dǎo)致細(xì)胞核呈不規(guī)則排列，表明模型組小鼠已呈明顯的脂肪肝狀態(tài)并且出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的肝腫大、肝細(xì)胞浸潤(rùn)性壞死。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠高血脂、脂肪肝合并肝損傷模型成功建立。

2.3 給藥處理結(jié)果

2.3.1 給藥處理后的血脂變化

對(duì)造模成功的高血脂、脂肪肝損傷小鼠改喂普通飼料并進(jìn)行給藥處理后，各組病小鼠精神萎靡、毛發(fā)凌亂糾結(jié)、食欲不佳及反應(yīng)遲鈍等癥狀在短短的2d時(shí)間即得到了改善，表現(xiàn)日漸活躍，皮毛恢復(fù)光滑、潔白，取食也更積極。進(jìn)行給藥處理兩周后，PMBL各劑量組小鼠血清TG、TCHO、LDL、HDL均有不同程度的變化。

從表3可知，PMBL各劑量組及PC組小鼠血清TCHO與NG組相比較仍然偏高，但差異已不顯著，血清LDL仍顯著高于NG組；HL組的TCHO、LDL均顯著或極顯著高于NG組；各實(shí)驗(yàn)組血清TG較灌胃處理前均有較大幅度提高，但仍顯著低于NG組；PMBL各劑量組及PC 組小鼠的血清TCHO、TG、LDL顯著或極顯著低于HL組(P＜0.01或P＜0.05)。血清HDL均略高于HL組，

表現(xiàn)為促進(jìn)HDL合成向好的趨勢(shì)，但相互之間無(wú)顯著性差異。

2.3.2 ALT活性、肝系數(shù)、肝粗脂肪含量及肝組織形態(tài)變化

對(duì)小鼠解剖取肝臟經(jīng)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，HL組小鼠肝臟體積與其余各組小鼠肝臟體積存在較大的差異，色澤也很淡，質(zhì)地松軟易碎，切面油膩，烘干至恒質(zhì)量后仍較軟，肝臟研磨后呈現(xiàn)明顯的油浸狀。而PMBL各劑量和PC組小鼠肝臟色澤除個(gè)別存在個(gè)體差異外，均呈現(xiàn)為深血紅色，肝臟質(zhì)地較柔韌，烘干至恒質(zhì)量后比較脆硬，研磨后的粉未呈干粉狀，色深。測(cè)定血清ALT、肝粗脂肪含量及計(jì)算肝指數(shù)結(jié)果如表4所示。

表4 PMBL對(duì)高血脂、脂肪肝合并肝損傷小鼠肝臟的影響Table 4 Effect of PMBL on hyperlipidemia and fatty liver associated with liver damage in mice

表4顯示， PMBL各劑量組及PC組的ALT活性、肝臟系數(shù)、肝粗脂肪含量與NG組接近或相差很小，而顯著或極顯著低于H L組，綜合作用效果依次為：HPMBL組＞MPMBL組＞PC組＞LPMBL組。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織切片對(duì)比圖(×20，HE染色)Fig.2 Comparison of liver tissues in mice (×20，HE)

圖2的肝組織病理切片顯示，經(jīng)藥物治療后的各組小鼠肝組織形態(tài)得到明顯恢復(fù)，其中MPMBL、HPMBL組小鼠肝細(xì)胞大小、細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)接近正常組小鼠，細(xì)胞漿中幾乎無(wú)脂肪空泡及浸潤(rùn)性壞死細(xì)胞出現(xiàn)，LPMBL和PC組仍有少量脂肪空泡，但數(shù)量少、個(gè)體都比較小，而HL組則仍然遺留有大量個(gè)體較大的脂肪空泡細(xì)胞浸潤(rùn)性壞死部分。表明PMBL各劑量及陽(yáng)性藥物血脂康均能顯著改善肝腫大、降低肝粗脂肪含量，修復(fù)肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能，有效地促進(jìn)肝損傷的快速恢復(fù)，具有顯著的利肝清脂、治療脂肪肝的功效。

3 結(jié) 論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMBL對(duì)高血脂脂肪肝損傷具有顯著的降脂利肝功效。不同劑量PMBL均能顯著降低高血脂、脂肪肝合并肝損傷小鼠的血清T G、T C H O、LDL、ALT活性和肝粗脂肪含量，有效改善病鼠的肝功能，促進(jìn)病鼠肝損傷修復(fù)。

3.2 研究結(jié)果可為PMBL的藥物開(kāi)發(fā)可行性提供參考。作為天然植物提取物，PMBL具有無(wú)細(xì)胞毒性及其他副作用的優(yōu)點(diǎn)，從而使其具有成為藥物基料或保健食品基料的可能，可為毛竹葉的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Effect of Polysaccharide from Moso Bamboo Leaves on Blood Lipid of Mice with Hyperlipemia

DING Hong-xiu1,2，GAO Yin-yu2,*，CHAO Hong-juan2，XIA Dong-hua2
(1. College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to investigate the functions of polysaccharide from moso bamboo leaves (PMBL) for decreasing blood lipid and liver lipid and promoting the recovery of damaged liver, the mice model with hyperlipidemia was established through the feeding of high-fat food to evaluate the effect of PMBL on lipid metabolism of mice. Totally 50 mice were divided into 5 groups designated as hyperlipidemia model group, PMBL groups at low, middle and high dosages, and positive control group. Blood lipid, serum ALT, crude fat content in liver, liver index and morphological change of liver tissues were evaluated. Results indicated PMBL could result in a significant reduction of total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein in serum; however, no significant effect on high-density lipoprotein was observed. In addition, PMBL could decrease crude fat content in liver, and improve the hepatic function of mice. In a word, PMBL exhibited anti-lipidemic activity and lipid-reducing effect in liver to enhance the repairing of damaged liver in mice with hyperlipidemia at the condition of optimal dosage.

polysaccharide from moso bamboo leaves；hyperlipemia；fatty liver；blood-lipid lowering；hepatic function

Q71；O629.12

A

1002-6630(2010)09-0259-04

2009-08-04

教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT0540)

丁紅秀(1971—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源開(kāi)發(fā)利用。E-mail：sd_dinghx@sina.com

*通信作者：高蔭榆(1940—)，女，教授，研究方向食物(含生物質(zhì))資源開(kāi)發(fā)利用。E-mail：yygaoncu@163.com