米糠抗氧化肽大鼠體外抗氧化作用研究

樊金娟，羅 霞，付巖松，張幼竹，劉廣文

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

米糠抗氧化肽大鼠體外抗氧化作用研究

樊金娟，羅 霞，付巖松，張幼竹，劉廣文

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

對(duì)米糠抗氧化肽體外抗氧化作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，米糠抗氧化肽(0.32mg/mL)能夠抑制血紅蛋白氧化反應(yīng)和紅細(xì)胞溶血，抑制率為50%左右，表明其對(duì)大鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白的氧化損傷具有保護(hù)作用；米糠抗氧化肽能抑制紅細(xì)胞及肝組織自氧化產(chǎn)生的MDA和由H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA，抑制率為41%～60%；并能抑制自由基誘導(dǎo)的大鼠肝組織勻漿中脂褐質(zhì)的產(chǎn)生。

米糠抗氧化肽；抗氧化；體外

抗氧化劑是生物體實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)的最根本性機(jī)制。在生物體內(nèi)，自由基的增多對(duì)生物大分子和膜結(jié)構(gòu)均有不同方式的損傷作用，造成相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1]。來源于食物蛋白水解物的肽類，不僅具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，而且無論是從細(xì)胞生理學(xué)還是代謝功能上越來越顯示出優(yōu)勢(shì)。它們與機(jī)體的各種功能調(diào)節(jié)、疾病的發(fā)生以及免疫、內(nèi)分泌、衰老、代謝等有著非常密切的關(guān)系，在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，可廣泛用作藥物、疫苗和食品營養(yǎng)制劑等。

本實(shí)驗(yàn)以米糠蛋白酶解物經(jīng)分子篩層析、離子交換層析等分離純化過程獲得的米糠抗氧化肽為原料，從體外實(shí)驗(yàn)研究米糠抗氧化肽的抗氧化活性，為深入研究米糠肽生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

米糠抗氧化肽的制備、分離純化，按本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行[2]。

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200g左右，由長春醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 米糠抗氧化肽對(duì)血紅蛋白氧化反應(yīng)的影響[3-4]。

Wistar大鼠斷頭取血，制成抗凝血，以1500r/min，4℃離心5min得紅細(xì)胞，用冷生理鹽水洗3次，用pH7.4的PBS配成20%的紅細(xì)胞懸液5mL，加入20倍5mmol/L的低滲PBS，4℃溶血30min，18000r/min離心30min，取上清液。1)自氧化體系：取溶血液2mL，加入0.32mg/mL的米糠抗氧化肽100μL，37℃溫育24h；兩支對(duì)照管加入100μL蒸餾水，其中一支37℃溫育24h；2)H2O2啟動(dòng)的氧化體系：加樣方式同自氧化體系，3 7℃溫育10min，加入30mmol/L的H2O2100μL，37℃振蕩溫育45min，于500～700nm波長處，2nm/s掃描。

1.2.2 米糠肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞過氧化溶血的影響[5-7]。

1)紅細(xì)胞自氧化溶血系統(tǒng)：取1%紅細(xì)胞懸液10mL，分別加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，對(duì)照管加100μL蒸餾水，

37℃溫育24h。2) H2O2誘發(fā)的紅細(xì)胞氧化溶血系統(tǒng)：加樣方法同1)，37℃溫育10min，加入終濃度為100mmol/L的H2O2，37℃振蕩溫育60min。將各系統(tǒng)在1000r/min離心10min，上清液于415nm測(cè)定吸光度，計(jì)算紅細(xì)胞氧化溶血抑制率。另取上清1 m L，用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量[8]。

式中：A0為對(duì)照管吸光度；A為樣品管吸光度。

1.2.3 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

1.2.3.1 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量的影響[9-10]。

取5%肝勻漿2mL，分別加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，對(duì)照管加入100μL蒸餾水，37℃溫育10min，加入終濃度為1mmol/L的H2O2，37℃反應(yīng)30min。取出反應(yīng)液1mL，TBA法測(cè)定MDA含量。

1.2.3.2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)含量的影響

參照文獻(xiàn)[11]，稍加改進(jìn)。取5%的肝組織勻漿5mL，分別加入0.16、0.24mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 200μL，對(duì)照加等量蒸餾水，37℃溫育10min，加入終濃度為12mmol/L 的H2O2，37℃反應(yīng)150min。各管加入體積比2∶1的氯仿甲醇液5mL混勻，3000r/min離心10min，向提取液中加入甲醇0.2mL，輕振混勻，置紫外燈下照射30s，用熒光分光光度計(jì)在波長300～400nm范圍內(nèi)掃描最大激發(fā)波長，然后以該波長在400～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)射波長掃描，熒光強(qiáng)度代表脂質(zhì)過氧化程度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠抗氧化肽對(duì)血紅蛋白氧化反應(yīng)的影響

氧合血紅蛋白是血紅蛋白和氧分子的絡(luò)合物。血紅素鐵原子為二價(jià)，與O2、卟啉的4個(gè)N、珠蛋白的組氨酸殘基(咪唑基)結(jié)合，成為八面體的絡(luò)合物，分別在540nm(血紅蛋白β鏈)和575nm(血紅蛋白α鏈)波長處有特異吸收峰。高鐵血紅蛋白(MetHb)及血紅蛋白鐵喪失一個(gè)電子，在630nm波長有特異吸收峰。正常高鐵血紅蛋白占血紅蛋白總量的1%，較為穩(wěn)定。

當(dāng)紅細(xì)胞發(fā)生氧化后，氧合血紅蛋白的吸收峰降低，其中α鏈最為敏感；而高鐵血紅蛋白的吸收峰增高(圖1、2)，更易加速類脂的過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

圖1 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞自氧化體系中血紅蛋白含量的影響Fig.1 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in autoxidation system

圖2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞H2O2誘導(dǎo)氧化體系中血紅蛋白含量的影響Fig.2 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in H2O2-induced oxidation system

由圖1、2可知，米糠抗氧化肽無論對(duì)自氧化體系還是H2O2誘導(dǎo)氧化體系中的血紅蛋白氧化反應(yīng)都有一定的抑制作用，抑制率分別為20.86%和22.17%。Stratford等[12-13]曾報(bào)道，內(nèi)脂可加速Hb的氧化速率，異丙酚能抑制脂質(zhì)誘發(fā)的這種加速作用，但并不抑制潛在的氧自由基誘發(fā)的氧化反應(yīng)。由此推斷，米糠抗氧化肽對(duì)紅細(xì)胞自由基損傷的保護(hù)作用可能與異丙酚相似，主要通過對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的抑制作用，從而保護(hù)紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，而對(duì)Hb氧化作用的影響可能是次要的。

2.2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞過氧化的影響

紅細(xì)胞是血液中的主要功能成分，擔(dān)負(fù)著運(yùn)輸O2，排出CO2的重要任務(wù)。紅細(xì)胞膜中含有大量不飽和脂肪酸，在氧分壓過高時(shí)，可使紅細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化產(chǎn)生MDA，而MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，它可以交聯(lián)磷酯和蛋白質(zhì)，也可以使蛋白質(zhì)巰基氧化，從而損傷細(xì)胞膜，使之產(chǎn)生溶血[14-15]。在正常生理情況下，由于內(nèi)源性抗氧化劑的保護(hù)作用，紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能基本得到維持，但在疾病、衰老、環(huán)境毒物及受到輻射損傷情況下自由基對(duì)紅細(xì)胞膜的損

傷程度可能超過其修復(fù)能力，導(dǎo)致膜損傷而發(fā)生氧化溶血作用。通過紅細(xì)胞的氧化溶血反應(yīng)可以檢測(cè)自由基損傷程度，也可以通過該反應(yīng)來評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化效果。

2.2.1 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞過氧化溶血的影響

表1 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞過氧化溶血的影響Table 1 Effect of rice bran peptides on hemolysis of red blood cells

由表1可知，和對(duì)照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著米糠抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對(duì)溶血反應(yīng)的抑制作用增加，且具有顯著作用(P＜0.01)。

雙氧水是很強(qiáng)的自由基誘導(dǎo)劑，在大鼠紅細(xì)胞溶液中添加后促進(jìn)了紅細(xì)胞的過氧化溶血反應(yīng)。與對(duì)照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著米糠抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對(duì)溶血反應(yīng)的抑制作用也增加，且具有顯著作用(P＜0.01)。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽抑制溶血的能力可與GSH相媲美。

2.2.2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞MDA含量的影響

表2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞MDA含量的影響Table 2 Effect of rice bran peptides on MDA content in red blood cells

由表2可知，與對(duì)照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，米糠抗氧化肽各劑量組對(duì)大鼠紅細(xì)胞自氧化和H2O2誘導(dǎo)生成的MDA均有顯著的抑制作用(P＜0.01)，說明米糠抗氧化肽在紅細(xì)胞水平上的抗氧化作用明顯。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽抑制MDA生成的能力與GSH相當(dāng)。

2.3 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的影響肝組織是動(dòng)物重要的代謝器官，其勻漿液中含有大量的細(xì)胞器和質(zhì)膜，在體外溫育過程中可以發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基，而這些自由基能通過攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物。因此，測(cè)定MDA的含量不僅可反映出組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，還能間接體現(xiàn)出細(xì)胞損傷程度。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，它可以交聯(lián)磷脂和蛋白質(zhì)，也可以使蛋白質(zhì)的巰基氧化生成脂褐質(zhì)。通過對(duì)脂褐質(zhì)的測(cè)定，可知細(xì)胞被自由基損傷的程度，間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。

2.3.1 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿MDA含量的影響

表3 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿MDA含量的影響Table 3 Effect of rice bran peptides on MDA content in liver tissue

由表3可知，與H2O2誘導(dǎo)對(duì)照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，米糠抗氧化肽各劑量組對(duì)大鼠肝組織勻漿H2O2誘導(dǎo)組生成的MDA有顯著的抑制作用(P＜0.01)，說明米糠抗氧化肽在肝組織水平上的抗氧化作用明顯。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽的抗氧化作用稍優(yōu)于GSH。

2.3.2 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)含量的影響

脂褐質(zhì)是丙二醛與游離的氨基類物質(zhì)(如磷脂酰乙醇胺，蛋白質(zhì)及核酸)交聯(lián)而生成的具有熒光的化合物，即Shill堿。用氯仿-甲醇混合為萃取劑，可將其從組織中提取出來。通過對(duì)脂褐質(zhì)的測(cè)定，可知道細(xì)胞被自由基損傷的程度，間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。通過熒光分光光度計(jì)在300～400nm范圍內(nèi)掃描得最大激發(fā)波長為359.6nm；然后在359.6nm最大激發(fā)波長下，在400～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得最大發(fā)射波長為431.3nm。在此波長下，測(cè)得米糠抗氧化肽對(duì)脂褐質(zhì)產(chǎn)生的影響。

表4 米糠抗氧化肽對(duì)大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)生成的影響Table 4 Effect of rice bran peptides on the generation of lipofasci in liver tissue

由表4可知，肝組織勻漿在H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基損傷作用下，形成了脂褐質(zhì)。與對(duì)照組相比，米糠抗氧化肽和GSH對(duì)脂褐質(zhì)的生成都有顯著抑制作用(P＜0.01)，且二者抑制能力接近。

3 結(jié) 論

3.1 米糠抗氧化肽可減緩自發(fā)體系和誘導(dǎo)體系中血紅蛋白被氧化的速率，對(duì)血紅蛋白有一定保護(hù)作用。

3.2 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各劑量組能極顯著地抑制紅細(xì)胞的過氧化溶血和丙二醛的生成，并呈一定的量效關(guān)系。

3.3 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各劑量組能顯著抑制肝勻漿的過氧化反應(yīng)。

自由基的增多會(huì)引起蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的氧化損傷，甚至破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)表明，米糠抗氧化肽能夠抑制血紅蛋白氧化速率及紅細(xì)胞過氧化溶血，同時(shí)能降低肝組織MDA和脂褐質(zhì)的產(chǎn)生，其抗氧化活性可與GSH相媲美，為進(jìn)一步研究米糠抗氧化肽的體內(nèi)抗氧化活性及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)活性提供了參考。

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Antioxidant Effect of Rice Bran Peptides in Rats

FAN Jin-juan，LUO Xia，F(xiàn)U Yan-song，ZHANG You-zhu，LIU Guang-wen
(College of Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

In this study, biological functions of rice bran antioxidant peptides were investigated. Results indicated that rice bran antioxidant peptides exhibited an effective scavenging capability to free radicals and inhibit peroxide reactions of hemoglobin and hemolysis of red blood cells (RBC); moreover, rice bran antioxidant peptides also revealed an excellent inhibition effect on MDA generated from RBC, liver tissue and H2O2 oxidation system. Furthermore, rice bran antioxidant peptides also could suppress the generation of lipofasci from liver tissues induced by H2O2.

rice bran antioxidant peptide；antioxidation；in vitro

TQ936.16

A

1002-6630(2010)09-0251-04

2009-07-03

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2008S207)

樊金娟(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：jinjuanf@hotmail.com