產(chǎn)谷氨酸脫羧酶片球菌的鑒定及其酶學性質

李 云，楊勝遠*，陳郁娜，劉祥流，麥真真，陳 燕

(韓山師范學院生物系食品與發(fā)酵工程研究所，廣東 潮州 521041)

產(chǎn)谷氨酸脫羧酶片球菌的鑒定及其酶學性質

李 云，楊勝遠*，陳郁娜，劉祥流，麥真真，陳 燕

(韓山師范學院生物系食品與發(fā)酵工程研究所，廣東 潮州 521041)

從發(fā)酵蔬菜中分離一株產(chǎn)谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)的乳酸菌HS2，其菌體細胞轉化Glu 1h，轉化液中γ-氨基丁酸含量可達(3.114±0.133)g/L，通過形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化特征、16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株HS2是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD最適作用溫度為35℃，最適作用pH4.5。酶的熱穩(wěn)定較好，在pH4.0～6.5于50℃處理4h，酶活基本穩(wěn)定。Ca2+對酶有激活作用，5mmol/L 和50mmol/L Ca2+濃度使酶活分別提高了37.21%和23.02%。Mg2+和Mn2+在50mmol/L濃度時激活作用明顯，而Co2+在5mmol/L濃度激活作用較好。

谷氨酸脫羧酶；戊糖片球菌；γ–氨基丁酸；菌種鑒定

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是存在于生物的一種重要的脫羧酶，催化L-谷氨酸(Glu)脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和CO2[1]。GAD廣泛分布于動物、植物和微生物體內(nèi)。在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其脫羧產(chǎn)物GABA是一種主要的抑制性神經(jīng)遞質，具有重要的生理功能[2]。在植物中，GABA 的合成與植物生長的逆境生理有重要關系[3]。細菌細胞內(nèi)的GAD酶系統(tǒng)是細菌對酸性環(huán)境的應激反應，維持體內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)的機制之一[4]。在真核微生物中，GAD在孢子的萌發(fā)過程中參與能量代謝和起代謝調控作用[5]。由于GAD在生物體內(nèi)存在的普遍性，對不同來源GAD的結構、功能及基因表達調控機制的闡明已成為當前研究的熱點之一。

微生物來源的GAD中，乳酸細菌(lactic acid bacterium，LAB)產(chǎn)GAD受到大量研究者的關注。乳酸菌在自然界中分布很廣泛，是人和動物腸道正常菌群。尋找高GAD活性的食品安全的乳酸菌株，或者采用基因工程技術獲得高GAD活力的基因工程菌，能夠開發(fā)安全高效的生物合成GABA工藝及富含GABA的保健食品。另外，闡明簡單低等生物GAD結構與功能的關系，能為復雜高等生物中GAD研究提供重要的線索。文獻已報道乳球菌屬(L a c t o c o c c u s)[6-7]、鏈球菌屬(Streptococcus)[8]、乳桿菌屬(Lactobacillus)[9-12]等的多種乳酸菌具有GAD活性，研究集中在GAD酶學性質、基

因克隆和表達等方面，然而尚未見有關于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)產(chǎn)GAD方面的報道。本實驗從自然發(fā)酵的蔬菜中分離和鑒定產(chǎn)GAD的戊糖片球菌，并研究其GAD粗酶的酶學性質。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、番茄汁培養(yǎng)基和脫脂牛乳培養(yǎng)基參照文獻[13]進行配制。

1.2 試劑與儀器

色譜純試劑 美國Tedia 和 Honeywell International INC 公司；DNA純化試劑盒 北京天為時代科技有限公司；γ-氨基丁酸(純度99.0%) Sigma公司；其他試劑為分析純。

PTC-100TMPCR儀 MJ Research公司；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(XDB-C18柱，15cm×4.6mm，5μm) Agilent公司；Sigma2-16離心機 Sigma公司；UY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 PCR引物

采用細菌1 6 S r D N A的通用引物：2 7 F：5＇-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，1541R：5＇-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分離

取自然發(fā)酵蔬菜(固體樣品預先破碎，菌較少樣品預先用適當培養(yǎng)基富集)，于無菌生理鹽水做10倍梯度稀釋。取合適稀釋度的稀釋液1mL分別注入無菌培養(yǎng)皿中，以無菌操作加入已加入1g/100mL CaCO3熔化的MRS瓊脂培養(yǎng)基(預冷至50℃以下)，培養(yǎng)基倒入平皿后搖勻。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取周圍有CaCO3溶解圈的菌落，于MRS平板上劃線純化。取純化后的菌落，涂布，革蘭氏染色，鏡檢，保留G+的菌株，于脫脂牛乳培養(yǎng)基保藏。

1.4.2 產(chǎn)GAD乳酸菌的篩選

取待篩選的菌株斜面培養(yǎng)18～24h活化后，接種于MRS液體培養(yǎng)基活化18～24h。分別吸取1mL經(jīng)活化的菌液至裝有100mL MRS培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，32℃培養(yǎng)24h，于4℃、8000×g離心15min收集菌體，0.9g/100mL的生理鹽水洗滌，于4℃、8000×g離心15min收集菌體，重復洗滌3次。按菌體量與谷氨酸鈉1∶10(V/V)的比例，加入1g/100mL L-谷氨酸鈉(溶于0.2mol/L pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液中)，混勻后，于35℃轉化1h，離心取上清液，得轉化液。

采用新華一號層析紙，吸取轉化后的上清液1μL進行點樣，用10mmol/mL GABA標準溶液和1g/100mL谷氨酸鈉溶液作對照，按0.4g/100mL的比例將顯色劑茚三酮加入展開劑中，展開劑的組成：正丁醇、冰醋酸、水體積比12∶3∶5，展程15～18cm。展開后于90℃條件下顯色10min。具有與GABA標樣展程一致的斑點的待測樣品，定性為具有產(chǎn)GAD活性的菌株。參照文獻[14]采用高效液相色譜法對轉化液中的GABA進行定量分析。

1.4.3 形態(tài)培養(yǎng)特征及生理生化特征實驗

形態(tài)、培養(yǎng)及基本生理生化特征實驗參照文獻[12,15]。生化特征實驗采用法國梅里埃vitek 32微生物自動鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.4.416 S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

按文獻[16]方法提取細菌基因組DNA，采用細菌16S rDNA的通用引物27F和1541R進行擴增。擴增體系為10mmol/mL MgCl23μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP (2.5μmol/L)4μL，TaqTM(5U/μL)0.25μL，上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，最后加雙蒸水至50μL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上95℃變性5min，然后94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min反應結束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結果。PCR產(chǎn)物通過電泳，利用北京天為時代科技有限公司凝膠回收試劑盒割膠回收純化。委托上海生工進行生物工程技術服務有限公司測序。將16S rDNA序列與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行同源性分析(http∶//www.ncbi.nlm. nih.gov/blast)，利用BioEdit_7.0.0 軟件的Clustal W程序進行多重比對，然后利用Clustal X1.8軟件采用Neighbour-joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行bootstrap分析，重復次數(shù)為1000次。

1.4.5 GAD制備

將濕菌體3g懸浮到30mL pH5.0的0.2mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液中，內(nèi)含0.01mmol/L磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)，1mmol/L二硫蘇糖醇，冰浴中超聲波破碎(400W，工作5s，間隔15s，全程90min)，4℃放置過夜，4℃離心(8000×g，20min)收集上清液，作為GAD酶液。

1.4.6 GAD活力測定

GAD酶轉化反應體系總體積400μL，其中GAD酶液100μL，L-Glu溶液(pH4.5，40mmol/L，含0.02mmol/L PLP)100μL，pH4.5的0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液200μL。混合后于35℃反應4h，加入4倍體積預冷的冰凍無水乙醇終止反應，然后參照文獻[14]采用高效液相色譜法測定GABA。在測定條件下1h生成1μmol

GABA所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。以相對酶活力比較不同條件處理的GAD活力大小。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)GAD乳酸菌的分離篩選

從自然發(fā)酵蔬菜中，分離到112株革蘭氏陽性、接觸酶陰性的菌株，初步確定為乳酸菌。待測乳酸菌經(jīng)菌體細胞轉化谷氨酸鈉，轉化液紙層析定性檢測，有9株菌轉化液樣與GABA標準有相同的遷移率，說明這些菌株具有GAD活力。轉化液的GABA含量測定結果(圖1)表明，菌株HS2的GAD活力最大，于35℃、0.2mol/L pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液中轉化1h，轉化液中GABA的含量達(3.114±0.133)g/L。

圖1 產(chǎn)GAD菌株轉化液的GABA含量Fig.1 The concentration of GABA in transformed liquid with GAD-producing strains

2.2 菌株HS2的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株HS2于35℃ MRS培養(yǎng)基生長24h，菌落細小，表面平滑、呈圓形、灰白色、邊緣整齊，培養(yǎng)48h菌落直徑約1～2mm。革蘭氏染色觀察表明菌株HS2為革蘭氏陽性、無芽孢、圓球形、菌體直徑約1μm；細胞呈對生，非鏈狀排列，沿兩個垂直方向分裂形成的四聯(lián)排列(圖2)。

圖 2 菌株HS2菌體形態(tài)(×1000)Fig.2 Morphology of strain HS2 (×1000)

2.2.2 菌株HS2培養(yǎng)及生理生化特征

參照文獻[12,15]進行培養(yǎng)及生理生化特征實驗，生理生化特征由vitek 32鑒定系統(tǒng)鑒定，結果見表1，各項特征符合文獻[12,15]關于片球菌(Pediococcus)的描述。

表 1 菌株HS2的培養(yǎng)及生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain HS2

2.2.316 S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株HS2總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小在1.5kb左右(圖3)。經(jīng)測序，菌株HS2的16S rDNA序列為1484bp，已在GenBank中登記，登記號(GenBank accession number)為：GQ465207。將菌株HS2的16S rDNA序列與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數(shù)據(jù)庫中報道的16S rDNA核苷酸序列進行比對，結果與數(shù)據(jù)庫中9株Pediococcus pentosaceus相似度最高(達99%)，初步將菌株HS2鑒定為Pediococcus pentosaceus。

圖3 菌株HS2 16SrDNA PCR擴增結果Fig.3 PCR of 16SrDNA of strain HS2

表 2 菌株HS2的16SrDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫比對結果Table 2 Comparison of 16SrDNA sequence of strain HS2 and the data from GenBank+EMBL+DDBJ+PDB database

以菌株HS2、片球菌屬(Pediococcus)各個種和部分已報道產(chǎn)GAD的球菌的16S rDNA核苷酸序列為基礎構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，菌株HS2與Pediococcus pentosaceus位于同一簇群，1000次bootstrap分析完全支持該分枝，與片球菌屬其他種的發(fā)育關系相對較遠(圖4)。

根據(jù)16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結果，結合形態(tài)特征、培養(yǎng)及生理生化特征，對照文獻[12,15]，鑒定菌株HS2為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。2.3菌株HS2 GAD的性質

2.3.1 溫度對菌株HS2酶活力的影響

GAD酶液在不同溫度(25、30、35、40、45、50、60℃)中作用于底物L-Glu測定酶活力，結果如圖5所示。菌株HS2 GAD酶最適反應溫度為35℃，在35～40℃范圍內(nèi)酶活力變化不大，超過40℃酶活力下降較快，60℃時相對酶活力僅35.30%。GAD酶液在不同溫度(4、40、50、60、70℃)保溫4h，再于35℃測定酶活力，結果表明在溫度低于50℃以下保溫，酶活力基本保持穩(wěn)定，損失不大，說明菌株HS2 GAD的熱穩(wěn)定較好。高于此范圍酶活力快速下降，60℃酶活力損失變大，70℃幾乎完全失去酶活。

2.3.2 pH值對菌株HS2 GAD酶活力的影響

用不同pH值(3.5～6.5)的緩沖液配制酶反應體系，于35℃測定酶活力，圖6表明該酶的最適反應pH值為4.5，pH4.5～5.0較適宜GAD進行催化反應，酶活力都在90%以上。當pH值低于4.5時酶活力逐漸下降，pH值高于5.0時酶活力急劇下降。菌株HS2 GAD在pH4.0～6.5間酶活力相對較穩(wěn)定，經(jīng)不同pH值的緩沖溶液于35℃處理4h，相對酶活力仍保留90%以上；當pH值低于4.0或高于6.5時，GAD嚴重失活。

圖 5 溫度對菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of crude GAD from strain HS2

圖 6 pH值對菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of crude GAD from strain HS2

2.3.3 金屬離子對菌株HS2 GAD酶活力的影響

在酶反應體系中分別加入5mmol/L和50mmol/L不同種類的金屬離子，測定酶活力。

圖 7 金屬離子對菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions on the activity of crude GAD from strain HS2

圖7顯示：當金屬離子濃度為5mmol/L時，Ca2+和Co2+對菌株HS2 GA D有激活作用，Zn2+、Na+、K+、

Mn2+、Ba2+、Mg2+對酶活力的影響不大，Cu2+、Pb2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+對酶活力都有抑制作用，其中Hg2+對GAD酶活性的抑制作用最強，幾乎完全抑制GAD活性；當金屬離子濃度為50mmol/L時，Ca2+、Mg2+、Mn2+對酶活力有明顯的激活作用，Zn2+和K+對酶活的影響不大，而Ba2+、Co2+、Pb2+、Na+、Cu2+、Hg2+、Fe3+對GAD酶活力都有不同程度的抑制作用，其中Fe3+、Hg2+幾乎完全抑制GAD活性。由此可知，Ca2+在兩個濃度均對酶有激活作用，酶活力分別提高了37.21%和23.02%。Mg2+和Mn2+在較高濃度時激活作用明顯，而Co2+在較低濃度激活作用較好。結果表明GAD受金屬離子的影響較大。

3 討 論

已報道的乳酸菌GAD[6,10-11,17]的最適作用溫度大多在其最適生長溫度附近，本實驗中的戊糖片球菌HS2的GAD最適溫度也符合其生長溫度條件。微生物來源的GAD 最適反應pH值在3.8～5.0[18]，已報道的乳酸菌的GAD[6,10-11,17]最適pH值在4.0～5.0。菌株HS2 GAD最適pH值為4.5，與乳酸菌來源GAD一致。金屬離子在一定的濃度下，對酶的活性有激活和抑制作用，特別是重金屬離子容易使酶失活。Ca2+對有HS2 GAD酶激活作用，Mg2+和Mn2+在較高濃度時激活作用明顯，而Co2+在較低濃度激活作用較好。與文獻[19]報道5mmol/L 的Mg2+對Lactococcus lactis SYFS1.009的GAD具有激活作用較為一致。

片球菌(Pediococcus)在乳酸菌的分類地位上，屬于干酪乳桿菌-片球菌群(L.casei-Pediococcus group)，對動植物不致病，常用于蔬菜、奶酪、肉和臘腸等產(chǎn)品的發(fā)酵，是一類應用于食品工業(yè)安全的微生物。片球菌的代謝產(chǎn)物細菌素片球菌素(pediocin) 具有天然安全及其耐熱耐酸的特性，作為一種生物防腐劑在食品發(fā)酵和食品保藏中得到廣泛的研究及應用[20]。戊糖片球菌(P. pentosaceus)常分離自植物和成熟的干酪，本實驗從發(fā)酵蔬菜中分離到安全的產(chǎn)G A D戊糖片球菌(P. pentosaceus)HS2，對于利用其GAD催化谷氨酸脫羧生物合成食品級GABA，以及開發(fā)富含GABA的發(fā)酵保健食品，具有較好的應用前景。

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Identification and Enzymological Characterization of Glutamate Carboxylase-producing Pediococcus

LI Yun，YANG Sheng-yuan*，CHEN Yu-na，LIU Xiang-liu，MAI Zhen-zhen，CHEN Yan
(Food and Fermentation Engineering Institute of the Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

A glutamate decarboxylase (GAD)-producing lactic acid bacteria (LAB) strain HS2 was isolated from pickled vegetable. When the biotransformation was conducted in cells with strain HS2 for 1 h, the content of γ-aminobutyric acid in biotransformation solution of strain HS2 was (13.114±0.133) g/L. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA and phylogenic analysis, the strain HS2 was identified as Pediococcus pentosaceus. The optimal temperature and pH for GAD activity were 35 ℃ and 4.5. The GAD from strain HS2 was stable at 50 ℃ for 4 h and resistant to pH in the range of 4.0－6.5. In addition, calcium ions could result in a significant increase of GAD activity, which resulted in an enhancement of GAD activity by 37.21% and 23.02% at the concentrations of 5 mmol/L and 50 mmol/L Ca2+. Similarly, Mg2+and Mn2+also could increase GAD activity at the concentration of 50 mmol/L, whereas Co2+could improve GAD activity at the concentration of 5 mmol/L.

glutamate decarboxylase；Pediococcus pentosaceus；γ–aminobutyric acid；strain identification

Q939.9

A

1002-6630(2010)09-0187-05

2009-09-25

廣東省自然科學基金項目(8452104101001546)；國家星火計劃項目(2008GA780032)；韓山師范學院科研基金資助項目

李云(1977—)，男，講師，碩士，研究方向為應用微生物學和發(fā)酵工程。E-mail：fgtmyself@yahoo.com.cn

*通信作者：楊勝遠(1972—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物學及生物技術。E-mail：yshengyuan2004@yahoo.com.cn