線粒體DNA在鱗翅目昆蟲系統(tǒng)學研究中的應用*

房守敏

(西華師范大學生命科學學院,四川南充 637002)

隨著分子生物學的發(fā)展,DNA序列用于昆蟲和其他動物系統(tǒng)發(fā)育和分子進化的研究越來越受到人們的重視。除了一些快速進化的核基因如無翅(wingless,Wg)[1]和延伸因子1α(elongation factor 1-alpha,EF-1α)[2]等能用于分子系統(tǒng)學研究外,線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)由于其進化速率快而備受關(guān)注。自Nass等[3]于1962年發(fā)現(xiàn)mtDNA以來,近年來人們對其基因組結(jié)構(gòu)和進化進行了深入細致的研究,發(fā)現(xiàn)線粒體基因組分子量小、拷貝數(shù)多、復合母系遺傳、不發(fā)生重組、突變率高等特點。動物和昆蟲的線粒體基因往往比核基因的進化速率分別快5～10倍[3]和2～9倍[4]。不同的線粒體基因有不同的進化速率,通常進化速率最大的是控制區(qū);蛋白編碼基因中的細胞色素氧化酶I(cytochrome oxidase I,COI)、COII和NADH脫氫酶亞基5(NADH dehydrogenase subunit 5,ND5)次之;核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)的大小亞基(12S和16S)較保守;進化速率最慢的是轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA,tRNA)。由于線粒體進化速率快和基因組相對較小等優(yōu)點,mtDNA已被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育、分子進化、昆蟲分類學和群體遺傳學等研究[5]。

鱗翅目(Lepidoptera)有40個以上的總科、約120個以上的科及18萬種,是僅次于鞘翅目的第二大目,包括蝶類和蛾類。鱗翅目昆蟲是完全變態(tài)生物,發(fā)育過程分為卵、幼蟲、蛹及成蟲四個時期,是研究昆蟲擬態(tài)、與寄主植物關(guān)系、翅膀模式發(fā)育生物學和昆蟲生理等研究的重要模式生物。目前,GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中鱗翅目昆蟲約有68條線粒體全基因組序列,其中47條來自蠶蛾總科(Bombycoidea)[6-9],這可能是由于家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲并且也是鱗翅目昆蟲的模式生物的緣故。另外,有成千上萬條的鱗翅目線粒體基因序列被測定,這些序列已被廣泛應用于群體遺傳結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)生分析等研究。本文主要對線粒體DNA在鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學研究的應用,以及不同線粒體DNA區(qū)段在鱗翅目昆蟲不同分類階元的適用性進行了綜述,為今后鱗翅目昆蟲系統(tǒng)發(fā)生分析提供參考。

1 鱗翅目昆蟲mtDNA結(jié)構(gòu)特征

鱗翅目昆蟲mtDNA與其他動物一樣,是閉合雙連環(huán)狀DNA分子。目前GenBank中鱗翅目昆蟲mt全基因組的大小為14 535 bp(玉米螟Ostrinia nubilalis,Accession no.AF442957)～16 094 bp(瑪愛杰鳳蝶Papiliomaraho,Accession no.NC_003395)。線粒體全基因組包括13個蛋白編碼基因(COI、COII和COIII;細胞色素氧化酶亞基b基因Cytb;ATPase復合物亞基ATP6和ATP8基因;ND1～6和ND4L)、12S rRNA、16S rRNA、22個tRNA及1個A+T富集區(qū)。A+T富集區(qū)有控制mtDNA的復制和轉(zhuǎn)錄的功能,又叫控制區(qū)(control region,CR)。線粒體基因組各基因間排列緊密,僅存在較短的基因間隔序列。例如中國野桑蠶mt基因組含有17個基因,間區(qū)僅391 bp[10]。而且線粒體基因不含內(nèi)含子,部分基因還存在重疊現(xiàn)象[10]。因此,線粒體堿基的使用節(jié)約、高效。

2 mtDNA應用于鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學的研究

2.1 蛋白編碼基因

蛋白編碼基因是線粒體的重要組織部分,對于完成線粒體全基因組測序的鱗翅目昆蟲而言,常用13個基因的核酸或氨基酸連接序列進行分子進化的研究[10-11]。但更多的是選取線粒體的部分代表性基因進行相關(guān)的分子系統(tǒng)學的研究。

2.1.1 COI與COII基因

我們對PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中截至2009年的文獻進行分析與整理,發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學的研究中COI與COII基因的應用最廣,至少有51項研究涉及利用了COI和(或)COII基因,而且COI基因的應用更為廣泛(表1)。這些研究中還常常結(jié)合線粒體的其他基因或區(qū)段(16S rDNA、ND5和控制區(qū)等)及核基因Wg(wingless)和EF-1α(elongationfactor 1-alpha)共同揭示鱗翅目昆蟲的進化關(guān)系。表1還顯示,利用COI/COII基因分析鱗翅目蛺蝶科Nymphalidae、鳳蝶科Papilionidae和灰蝶科Lycaenidae等昆蟲系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究較多。

表1 線粒體COI/COI I基因在鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學的研究中的應用

續(xù)表1 線粒體COI/COII基因在鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學的研究中的應用

COI基因已被較多地應用于鱗翅目昆蟲種內(nèi)、種間及屬間分子系統(tǒng)學研究。DeChaine和Martini[12]對落基山脈20個不同區(qū)域帕納塞斯蝶Parnassius smintheus的385個個體COI基因進行了測序,進化分析發(fā)現(xiàn)在落基山脈的北部和南部至少存在兩個多樣化的中心,并且利用巢式進化支分析(nested clade analysis)揭示出該物種經(jīng)歷了多次的群體擴增和分裂事件。Rand等[13]以COI基因?qū)业艭hrysoritis、Poecilmitis和Oxychaeta三個屬的昆蟲進行分子系統(tǒng)發(fā)生分析時發(fā)現(xiàn)3個屬應歸屬于同一個Chrysoritis屬,這與基于形態(tài)特征的系統(tǒng)假設(shè)一致。Hwang等[14]分析發(fā)現(xiàn)家蠶COI基因與野桑蠶、日本柞蠶Antheraea yamamai和中國柞蠶A.pernyi的序列相似性分別為97%、85%和87%,基于COI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹表明大蠶蛾科和蠶蛾科呈單源系起。Behere等[15]以COI基因部分序列對夜娥科Noctuidae的昆蟲作了進化分析,表明澳洲棉鈴蟲Helicoverpa punctigera在進化上先于煙草夜娥H.assulta,而后相繼分化形成棉鈴蟲H.armigera和玉米夜蛾H.zea,并且北美和南美大陸的H.zea從H.armigera祖先分歧年代非常近＜1.5百萬年前(million years ago,Mya)。

COII基因在鱗翅目昆蟲亞種及種間的分子進化研究中有一定的應用。Long等[16]對大二尾蛺蝶Polyura eudamippus 5個亞種的50個樣本COII基因的單倍型進行了分析,結(jié)果表明在405bp的COII部分序列中共發(fā)現(xiàn)了9種單倍型,5個亞種的地理分布與單倍型空間分布基本一致,并且推測在冰河期以后大二尾蛺蝶采取了兩條線路的擴張,一條是向北至四川、重慶和湖北,另一條則是向東至中國大陸的東南海和臺灣。Ohno等[17]以COII基因?qū)⒄让鳲strinia latipennis群體的兩個種O.latipennis(Warren)與O.ovalipennis Ohno進行分子進化研究,發(fā)現(xiàn)其親緣關(guān)系較近,約在0.3百萬年前發(fā)生的分歧。王戎疆等[18]利用線粒體COII基因?qū)ξ餐惖麑?個種的12個樣品分析,在405bp長的COII片段有11.4%的位點為多態(tài)性位點,在進化上尾蛺蝶屬蝴蝶分為兩大分支,一支包括大二尾蛺蝶、二尾蛺蝶和忘憂尾蛺蝶,另一分支包括窄斑鳳尾蛺蝶和黑鳳尾蛺蝶。這些分子系統(tǒng)學的結(jié)果均與形態(tài)學的結(jié)果相一致。

相對于COI或COII單基因研究而言,COI和COII基因的連接序列有著更廣泛的應用,它可用于屬、種及亞種分類階元的進化分析,而且還常用于分歧年代的估算。1994年,Brown等[19]對絲蘭蛾科(Prodoxidae)Greya屬16個種的COI+COII基因765 bp序列作了進化分析,其結(jié)果與形態(tài)分類大致相似。1999年,Caterino和Sperling[20]初次對鳳蝶22個種和1個亞種的COI和COII基因測序,研究者分別以COI、COII和COI+COII的核酸序列作進化分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅以COI基因不能支持garamas與scamander世系單系起源,COII則不能解決Papilionini科單系起源問題,而COI+COII則能較好地消除這兩個問題,因此非常適宜于鳳蝶亞屬及種間的分子進化研究。2004年,Zakharov等[21]利用COI+COII對鳳蝶的51個種進行了系統(tǒng)發(fā)育分析,參考考古學證據(jù),估算出了系統(tǒng)發(fā)生樹每個節(jié)點的分化年代,同時計算出了鳳蝶COI+COII的每年每位點的替換率為7.8×10-9～10.2×10-9,由此認為鳳蝶COI+COII的進化速率比昆蟲的“標準”速率[22]慢2-4倍。2008年,Pan等[10]利用鳳蝶COI+COII的進化速率作為分子鐘對蠶的進化年代進行了估算,結(jié)果表明家蠶與中國野桑蠶的分歧年代為1.08～1.41百萬年。

COI/COII與其他一些線粒體基因和核基因結(jié)合對鱗翅目昆蟲系統(tǒng)發(fā)育和分子進化的研究也是非常有用的工具之一。其他的線粒體基因或區(qū)域主要包括12S rRNA、16S rRNA、ND5及控制區(qū);核基因則主要是EF-1α和Wg基因(表1)。2001年,Monteiro和Pierce[23]將COI、COII和EF-1α基因應用于Bicyclus屬54個種的系統(tǒng)發(fā)育分析,他們分別建立了單基因和COI+COII+EF-1α基因連接序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)COI+COII+EF-1α基因連接序列的系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)分類的結(jié)果較一致。在此后幾年里,有更多的研究人員將COI/COII和EF-1α/Wg等結(jié)合起來研究鱗翅目昆蟲一些種屬間的關(guān)系(表1)。因此,mt基因與核基因結(jié)合也是研究昆蟲系統(tǒng)發(fā)育和分子進化一個切實可行的方法。

2.1.2 ND5基因

ND5基因是線粒體中快速進化的基因之一,其基因長度也比較適合分子進化[24]。1999年,Yagi等[25]以ND5基因?qū)θ毡绝P蝶不同科的代表性物種進化關(guān)系進行研究時,發(fā)現(xiàn)鳳蝶科Papilionidae與其他科形成不同的進化類群,而且在Papilionidae中分為兩個亞族,這一結(jié)論與傳統(tǒng)分類一致。2001年,Yagi等[26]又以ND5基因?qū)θ毡救簫u和亞洲大陸東部的鳳蝶P.glacialis和P.stubbendorf ii的進化關(guān)系作了詳細分析,發(fā)現(xiàn)這兩個種起源于共同的祖先,其大致分歧年代在1.7～2.0 Mya。Omoto等[27]利用ND5基因主要對絹蝶Parnassius的進化關(guān)系作了探討,結(jié)果表明該屬為單系起源,其內(nèi)部可以分為多個類群,即顯示在進化過程中該物種發(fā)生了相對快速的擴散。2002年,Yukuhiro等[7]以甲蟲ND5基因的進化速率(遺傳距離為0.01,分化時間等于3.6百萬年)作為分子鐘,估算出了家蠶和日本野桑蠶分歧時間約為7.1百萬年前。

除單獨用于進化研究外,ND5基因也可結(jié)合其他mt基因同時用于鱗翅目昆蟲分子系統(tǒng)學研究。2008年,Albre等[28]以ND5和COII基因?qū)rebia tyndarus種群的種和亞種的親緣關(guān)系進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以ND5或COII的進化樹拓撲結(jié)構(gòu)基本一致,ND5+COII連接序列構(gòu)建的進化樹表明Erebia tyndarus種群可以分為兩個不同的進化枝,且鑒別出了11個新種。因此ND5基因已被用于鱗翅目昆蟲的亞種、種、屬和科等分類階元的分子系統(tǒng)學研究。

2.1.3 Cytb基因

2005年,Li等[29]利用Cytb基因探討了蠶蛾屬中的家蠶和野桑蠶的起源與進化關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個家蠶品種與日本野桑蠶Cytb基因核苷酸水平的差異為5.4%～5.8%,而與中國鎮(zhèn)江野桑蠶的差異僅為0.8%～1.9%,進化樹也顯示家蠶與中國野桑蠶的親緣關(guān)系更近,這與公認的家蠶起源于中國野桑蠶一致。陳永久等[30]測定了4種云南白馬雪山和1種新疆天山的珍稀絹蝶Cytb基因部分序列,研究表明西猴絹蝶Parnassius simo分化較早,其次是珍珠絹蝶Parnassiusorleans和阿波羅絹蝶Parnassius apollo,巴裔絹蝶Parnassiusbaileyi和愛坷絹蝶Parnassius acco的遺傳關(guān)系較近,且分化較晚,與形態(tài)學結(jié)果相吻合。

2.2 核糖體RNA基因

線粒體核糖體RNA分為大小兩個亞基,其中16S rRNA應用于分子系統(tǒng)學的研究相對較為廣泛。1999年,Hwang等[31]用12S和16S rRNA基因?qū)πQ蛾科與大蠶蛾科的親緣關(guān)系進行研究,分別以12S和16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的拓撲結(jié)構(gòu)相同,進化樹顯示蠶蛾屬與大蠶蛾屬為單系起源。2008年,劉彥群等[32]以12S rRNA基因序列對鱗翅目柞蠶屬、樗蠶屬和桑蠶屬等9種絹絲昆蟲之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進行了研究,從分子水平證實了所發(fā)現(xiàn)的野生柞蠶仍屬于中國柞蠶種,進化分析支持柞蠶屬、樗蠶屬和桑蠶屬的單系起源。Mahendran等[33]利用16S rRNA對大蠶蛾科Satumiidae和蠶蛾科14個不同物種的系統(tǒng)發(fā)生分析也佐證了大蠶蛾科和蠶蛾科呈單系起源的觀點。2007年,Sobti等[34]以16S rRNA對6個北印度蝴蝶種的遺傳關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),6個種按屬聚為2個不同的類群,并指出結(jié)合rRNA與蛋白編碼基因?qū)⒛軓牟煌姆诸愲A元上更好地理解鱗翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。另外,國內(nèi)也有利用16S rRNA對蛺蝶科、鳳蝶科內(nèi)亞科主要類群進化關(guān)系的研究報道[35-36]。

目前,已有部分研究將rRNA與線粒體蛋白編碼基因結(jié)合起來研究鱗翅目昆蟲的進化關(guān)系。Aubert等[37]研究了鳳蝶屬(Papilio)種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,當分別利用16S rRNA、ND1(僅密碼子第一二位堿基)以及16S rRNA+ND1(僅密碼子第一二位堿基)連接序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹,發(fā)現(xiàn)16S rRN A+ND1的系統(tǒng)發(fā)生樹最切合實際。另外,還有少量應用16S rRNA+ND1連接序列在蝴蝶種屬分子進化的研究報道[38-39]。Wahlberg和Zimmermann[40]測定了蛺蝶科網(wǎng)蛺蝶族Melitaeini 13屬77個物種的16S rRNA和COI基因的部分序列,系統(tǒng)發(fā)生樹顯示大多數(shù)前人所定義的屬都是并系的,但發(fā)現(xiàn)Euphydryas、Phyciodes、Chlosyne和Melitaea為單系群,進化樹并暗示melitaeines起源于新北區(qū),然后曾三次擴散到新熱帶區(qū)和兩次擴散到古北區(qū)。2004年,Lange等[41]利用16S rRNA和COII的部分序列對夜蛾科Noctuidae和螟蛾總科Pyraloidea 10屬和6個族的26個種進行分子進化研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)夜蛾科為單系起源,而螟蛾總科呈并系發(fā)生;并且夜蛾科內(nèi)Sesamia和Bathytricha也是單系發(fā)生,而且Busseola是Bathytricha發(fā)生的基礎(chǔ)。

2.3 控制區(qū)

在過去的十年間,線粒體控制區(qū)已被廣泛應用于動物群體遺傳和分子進化等研究。但是昆蟲控制區(qū)是否能用于分子系統(tǒng)學等研究一直爭論不休[42]。2004年,Vila等[43]對控制區(qū)是否能用于鱗翅目昆蟲分子進化研究進行了新的評價。他們對蛺蝶科的15個種進行系統(tǒng)發(fā)生分析時發(fā)現(xiàn),控制區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹比用COI基因更能反映蛺蝶科內(nèi)真實的起源進化關(guān)系。并進一步指出,在解決快速進化的種分類水平的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系時,CR+COI基因可能是一個非常有用的工具。2005年,Vila等[44]就以CR+COI基因序列對蛺蝶科Erebia triaria蝴蝶世系的初始分化與雜交進行了研究,其結(jié)論支持在第四紀期間伊比利亞半島不是唯一的避難所,而是山脈與不同冰河時期的復雜分布促進了群體的隔離。

3 展望

mtDNA已被廣泛應用于鱗翅目昆蟲的近緣種、屬、科甚至是目等分類階元的系統(tǒng)發(fā)生分析和分子進化等研究。但是不同的mt基因進化速率不同,而且編碼基因密碼子的第三位堿基和控制區(qū)容易發(fā)生替換而達到飽和,加之外群選擇不當,常會引起系統(tǒng)發(fā)生樹長枝吸收效應直接影響分析的結(jié)果[45]。因此mt基因用于系統(tǒng)發(fā)育和分子進化等研究也有其適合的領(lǐng)域,在不同的物種中可能選擇mt基因不同,在不同分類階元也有各自適合的基因。通常親緣關(guān)系較遠的物種,一般選取比較保守的基因;親緣關(guān)系較近的物種,則選取選擇進化速率較快的序列?？v觀鱗翅目的研究,COI和COII基因應用最廣,并且結(jié)合線粒體其他基因或區(qū)段(ND5、12S rRNA、16S rRNA及CR)或核基因(EF-1α、Wg)等進行鱗翅目昆蟲的分子系統(tǒng)學研究也有著不可替代的優(yōu)勢。相信mtDNA序列將在昆蟲分子系統(tǒng)學研究中有著更為廣闊的空間,并隨著各物種進化研究的相繼開展必將為瀕危物種的保護,多樣性的保持和種質(zhì)資源的保存帶來新的希望。

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