蠶類抗菌肽異源表達(dá)與應(yīng)用研究進(jìn)展*

馬振剛 藍(lán)希鉗 周澤揚(yáng),2*

(1.西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑學(xué)重點實驗室,重慶400716;2.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶400047)

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展中,抗生素以其極佳的抗菌作用在細(xì)菌性疾病治療過程中占據(jù)了主要地位,它為人們治療微生物感染疾病提供了新的方向,為人類健康事業(yè)做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。但是隨著抗生素的大量應(yīng)用,細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和新生抗生素的篩選瓶頸使得抗生素的應(yīng)用受到一定的制約。近年來的研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽(Antimicrobal peptides,AMPs)以其獨(dú)特的作用機(jī)理和分子特性成為抗生素最為理想的替代藥物。

抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的短肽免疫效應(yīng)因子,在生物機(jī)體的先天免疫中起著重要的作用。自從1980年瑞典科學(xué)家Boman等人從惜古比天蠶(Hyalophora cecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到殺菌肽天蠶素(Cecropin)以來[2],在昆蟲中已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了200多種抗菌肽[3]?？咕姆肿恿啃?一般含6～60個氨基酸殘基。蠶類抗菌肽是指那些存在于蠶體及蠶蛹的血淋巴等免疫系統(tǒng)中,具有高效殺菌活性的肽類物質(zhì),具有抗菌譜廣、分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、作用機(jī)制獨(dú)特等特點。它成為昆蟲高效的先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,增強(qiáng)了蠶自身對病原微生物的抵抗力,減少了蠶類病原疾病的發(fā)生[4]。經(jīng)過最近二十幾年的研究顯示,抗菌肽不僅對細(xì)菌、真菌[5]有廣譜的抗菌活性,對病毒、原蟲[6]也有作用。

1 蠶類抗菌肽的家族分類

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,2006年中國蠶絲業(yè)生產(chǎn)價值達(dá)到1.77千萬美元[7]。由于家蠶容易飼養(yǎng),可利用的突變體多等特點使之成為繼果蠅之后的昆蟲遺傳學(xué)研究的模式生物。2003年家蠶基因組序列測序已經(jīng)完成[8];2007年,高精度的家蠶基因組數(shù)據(jù)得以誕生,夏慶友等人預(yù)測其基因數(shù)目大約為14,623個。2006年Tingcai Cheng等人[9]利用家蠶基因數(shù)據(jù)庫本地Blast鑒定了35個與其它昆蟲抗菌肽相似的氨基酸序列:包括Cecropins、Enbocins、Attacins、Moricins、Gloverins、和Lebocins等家族成員。2008年Wen等[10]進(jìn)行了家蠶De-fensin-like1(BmdefA)基因的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式的研究,鑒定出一個Defensin-like(BmdefA)基因。同年Yoichi Kaneko等人[11]從家蠶脂肪體中克隆得到了脂肪體組織特異性表達(dá)的Defensin-like2(BmdefB)基因。至此家蠶抗菌肽Defensin家族成員也被成功鑒定。

1.1 Moricins家族

家蠶抗菌肽Moricin是由Seiich Hara等人[12]于1995年首先發(fā)現(xiàn)的,是他們在研究家蠶血淋巴抗金黃色葡萄球菌的抗菌活性時分離得到的一種新型抗菌肽。此類抗菌肽可分為兩類,分別命名為Moricin1和Moricin2,它們的區(qū)別在于信號肽的第6位氨基酸殘基,Moricin1是Phe,Moricin2是Lys,相似度高達(dá)97.2%,成熟肽是完全相同的。用大腸桿菌注射家蠶幼蟲,在脂肪體、馬氏管組織中能觀察到Moricin基因表達(dá),而在絲腺、中腸沒有檢測到表達(dá)[11]。2006年,Tingcai Cheng等人[9]通過對家蠶數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽Moricins家族有12個成員,并將其分為家族A和B。家蠶Moricins前體包含65或66個氨基酸殘基,前22或23個氨基酸殘基是預(yù)測的信號肽,成熟肽有42個氨基酸殘基,具有強(qiáng)堿性,帶正電荷,等電點比天蠶素高,分子的N端每隔3～4個氨基酸殘基就有一個帶正電荷的氨基酸殘基(圖1a),C端富含堿性氨基酸殘基[13]?？咕腗oricins對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)的抗菌活性,用細(xì)菌脂多糖(LPS)能誘導(dǎo)家蠶Moricins的產(chǎn)生,說明Moricins的靶標(biāo)是細(xì)菌的膜部分[14],進(jìn)一步研究表明Moricins是通過增加膜的通透性而達(dá)到殺菌的作用。目前在其他昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了與家蠶Moricins相似性很高的類似抗菌肽[15],抗菌肽Moricins在不同種昆蟲中高度保守,推測其在進(jìn)化中具有重要地位。

圖1 家蠶抗菌肽氨基酸序列

1.2 Cecropins家族

1980年,Boman等從Hyalophora cecropia中首次分離出Cecropin。天蠶素廣泛存在于昆蟲中,目前人們已經(jīng)在鱗翅目的蛾類、蝴蝶及雙翅目的蠅類中純化出Cecropin。Cecropins由約40個氨基酸殘基組成,分子量約為4kDa,并且具有熱穩(wěn)定性。目前為止,家蠶Cecropin A、B、D、E都已經(jīng)有了研究報道[16-19],它們包含有2個α-螺旋結(jié)構(gòu),N-端富含親水氨基酸殘基,C-端富含疏水氨基酸殘基,主要是抗革蘭氏陰性菌,在細(xì)菌膜上形成離子通道引起菌體內(nèi)容物外流,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[20]。

1.3 Lebocins家族

Lebocins家族富含脯氨酸,由32個氨基酸殘基組成[21],第15(15-Thr)位是一個糖基化位點(圖1d),有利于提高抗菌肽活性。Lebocins的結(jié)構(gòu)和抗菌特征與蜜蜂的抗菌肽Abaecin相同。目前有3個Lebocins(Lebocin 1、2、3)得到分離,Lebocin 1和2氨基酸序列高度相似,Lebocin 4已被克隆,它與其它3個Lebocin高度相似。Lebocins在生理條件下抗菌活性很低,但是當(dāng)有Cecropin D或糖存在時能大大的增加其抗菌活性。在家蠶中,Cheng等[9]只鑒定到1個Lebocin,推測其它成員可能定位在家蠶基因組序列的gaps上。

1.4 Gloverins家族

Gloverins家族富含甘氨酸,且甘氨酸位置高度保守,不含有半胱氨酸,熱穩(wěn)定性好,能與脂多糖(LPS)相互作用,并特異的抑制菌體細(xì)胞壁形成,引起膜通透性增加,最終導(dǎo)致菌體緩慢生長甚至死亡。2006年7個Gloverin基因被Cheng等[9]在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中得以分析鑒定。

1.5 Attacins家族

抗菌肽Attacins富含甘氨酸,分子量約為20kDa,無半胱氨酸。昆蟲Attacin按其等電點的不同可以劃分為兩大類:堿性攻擊素和酸性攻擊素。經(jīng)過大量研究表明,Attacin與天蠶素(Cecropin)、防御素(Defensin)以及溶菌酶(Lysozyme)共同構(gòu)成了昆蟲非特異性先天免疫系統(tǒng)的主體[20]。2006年Cheng等[9]鑒定了2個家蠶Attacins基因,它們位于同一個scaffold上,與果蠅的Attacin基因相似。Attacin主要是對革蘭氏陰性菌起作用,抑制菌體外膜蛋白的合成達(dá)到殺菌的目的。

1.6 Defensin家族

Defensin家族抗菌肽分子量約4kDa左右,由約34-43個氨基酸殘基組成,富含半胱氨酸,主要對革蘭氏陽性菌起作用。2008年Wen等[10]通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和表達(dá)序列標(biāo)簽分析,獲得了一個Defensin-like(BmdefA)基因,該基因的開放閱讀框編碼了一個含有22個氨基酸殘基的信號肽,一個34個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽和一個36個氨基酸殘基的成熟肽,其成熟肽分子量約為4.0kDa;成熟肽包含了昆蟲Defensin共有的6個半胱氨酸基序,其理論等電點為4.12,因此我們推測這是一個新型陰離子抗菌肽。2008年Yoichi Kaneko[11]等人從家蠶脂肪體cDNA文庫中克隆獲得了Defensin-like2(BmdefB)基因,該基因編碼的抗菌肽能在蠶體受到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及真菌的誘導(dǎo)下大量的表達(dá)。雖然BmdefB同樣具有由6個保守的半胱氨酸殘基構(gòu)成的基序,但是它與BmdefA的氨基酸序列相似性只有27%(圖1c),且它是一種陽離子抗菌肽,推測它們可能來自不同的祖先[22]。

1.7 Enbocins家族

1998年Sang等[30]利用探針雜交法獲得了Enbocin基因,氨基酸序列與Cecropin家族類似,但是卻表現(xiàn)出不同的抑菌活性,Cecropins對抗革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑菌活性,而Enbocin對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用。2006年Cheng等[9]鑒定了2個家蠶Enbocin基因,其成熟肽氨基酸序列相似性極高(圖1b),基因染色體定位表明它們成簇的排列在同一條染色體上[22]。

2 蠶類抗菌肽的異源表達(dá)系統(tǒng)

2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

為獲得較純的抗菌肽樣品,同時為抗菌肽批量生產(chǎn),對抗菌肽異源表達(dá)的研究十分迫切且具有應(yīng)用意義。由于抗菌肽分子中存在堿性氨基酸殘基,因此蛋白酶對其影響顯著。同時,表達(dá)的抗菌肽對表達(dá)宿主菌具有抑制和殺傷作用,使得抗菌肽的異源表達(dá)量不高。目前,解決這一難題的方法有基因的串聯(lián)表達(dá)策略以及基因的融合表達(dá)策略,而研究者們主要采用抗菌肽的融合表達(dá)策略來解決抗菌肽在異源表達(dá)系統(tǒng)中遇到的問題,該方法是將抗菌肽基因與一個編碼較大蛋白質(zhì)分子的基因融合在一起共表達(dá),較大的蛋白質(zhì)分子能夠與抗菌肽本身的堿性氨基酸中和,并且暫時影響抗菌肽分子構(gòu)象,導(dǎo)致抗菌肽的殺菌活性下降,從而降低對宿主菌的殺傷作用;同時也增強(qiáng)了抗菌肽分子穩(wěn)定性,防止其被酶解。待獲得純凈的融合表達(dá)蛋白后,采用酶切或者化學(xué)剪切作用切除大分子標(biāo)簽,使抗菌肽分子恢復(fù)應(yīng)有構(gòu)象,并重新獲得較強(qiáng)的抑菌活性[23]。由于原核表達(dá)操作簡便(如圖2A),亦能獲得活性肽,許多研究者都采用此系統(tǒng)研究抗菌肽的異源表達(dá)。目前成功的融合表達(dá)系統(tǒng)主要有GST系統(tǒng)、β-半乳糖苷酶系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)系統(tǒng)等;純化標(biāo)簽融合表達(dá)也有一定的應(yīng)用,如His-tag、FLAG-tag和HA-tag等[24]。

1998年Seiichi Hara等[25]將Moricin基因克隆至原核表達(dá)載體pXa1 and pMAL-c2中,在大腸桿菌中成功表達(dá)具有抑菌活性的目的蛋白。2008年趙巖龍等[26]將家蠶抗菌肽Moricin基因與表達(dá)載體pET-32M連接,在大腸桿菌中融合表達(dá),成功純化出目的蛋白,并證明其對大腸桿菌具有抗菌活性;2008年韓晉輝等[27]根據(jù)天蠶素特征,設(shè)計了4條抗菌肽,將設(shè)計抗菌肽的基因克隆到載體pUC19上,在大腸桿菌JM109中融合表達(dá)目的多肽,抑菌圈法測定其抗菌活性,結(jié)果表明其中抗菌肽AMP-Cec具有較強(qiáng)的抑菌活性。

圖2 蠶類抗菌肽異源表達(dá)流程

2.2 真核酵母表達(dá)系統(tǒng)

目前發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類繁多,來源廣泛,其中真核生物抗菌肽占很大比重。由于原核異源表達(dá)系統(tǒng)缺乏對表達(dá)蛋白的加工與修飾,因此真核生物抗菌肽在其中表達(dá)往往活性較低或無活性。酵母表達(dá)體系是目前抗菌肽基因和生物工程中重要且應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)體系之一,該表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點:1能夠直接表達(dá)小分子肽;2具有外源蛋白的加工與修飾系統(tǒng);3基因操作相對簡單(如圖2B);4產(chǎn)物的表達(dá)量高、易大量發(fā)酵培養(yǎng)和易純化。因此在昆蟲抗菌肽表達(dá)研究方面有著重要的應(yīng)用。在現(xiàn)今的真核酵母表達(dá)系統(tǒng)中,常用的表達(dá)載體有pPICZα A、pGAPZα A和pPIC9K,由于其具有分泌蛋白的引導(dǎo)肽且能加工切除重組蛋白的信號肽,因此表達(dá)的目的蛋白能夠分泌到細(xì)胞外,從而避免酵母內(nèi)源蛋白酶對其降解,同時還便于后續(xù)純化目的蛋白,這些優(yōu)點使得酵母表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛的應(yīng)用。

2008年王秀青,張素芳等[28]亞克隆Cecropin B并將3個亞克隆串聯(lián)在一起,將串聯(lián)體克隆至表達(dá)載體pPICZα A上,電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168,甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),抑菌實驗結(jié)果表明重組蛋白具有明顯的抑菌活性。2009年王秀青,朱明星等[29]設(shè)計引物對前期構(gòu)建成功的載體天蠶素類雜合肽CecropinA-magainin進(jìn)行定點突變,使其生成雜合肽的衍生物,測序正確后轉(zhuǎn)化畢赤酵母受體細(xì)胞SMD1168,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,活性試驗表明其對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌活性。

2.3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

在抗菌肽的異源表達(dá)的研究過程中,針對抗菌肽結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基組成的特點,選擇不同的異源表達(dá)體系,除了眾多研究者采用的原核表達(dá)體系和真核酵母表達(dá)體系外,Sang等[30]于1998年用昆蟲細(xì)胞表達(dá)了具有抑菌活性的家蠶抗菌肽Enbocin,其將家蠶Enbocin基因克隆至表達(dá)載體pBacPAK9中,構(gòu)建重組桿狀病毒并轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞,培養(yǎng)4天后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清,通過抑菌圈試驗證實其能抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。截止到目前,由于細(xì)胞水平表達(dá)抗菌肽成本高且對試驗設(shè)備要求嚴(yán)格,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)并沒有得到廣泛的應(yīng)用。

3 蠶類抗菌肽異源表達(dá)研究現(xiàn)狀

過去幾年對蠶類抗菌肽的研究,以抗菌肽基因分析、肽結(jié)構(gòu)解析和天然抗菌肽的獲取[31-33]為主要方向。由于天然抗菌肽表達(dá)量低、提取過程復(fù)雜等原因,使得對抗菌肽結(jié)構(gòu)解析與作用機(jī)理的研究受到阻礙[34]。近年來,異源表達(dá)重組抗菌肽的研究逐漸增多,而各家族成員基因表達(dá)現(xiàn)狀具體見表1。從總體上來看,對蠶類抗菌肽異源表達(dá)的研究進(jìn)展處于剛剛起步階段,其相關(guān)報道遠(yuǎn)少于家蠅等其他物種,如Attacin、Defensin與Lebocin等家族的異源表達(dá)研究仍無文獻(xiàn)報道。由于蠶類抗菌肽基因?qū)儆谡婧松锘?原始表達(dá)的抗菌肽可能經(jīng)過真核系統(tǒng)的修飾與加工,但現(xiàn)今大多數(shù)研究采用原核異源表達(dá)體系,如Moricin[25]與Gloverin[35]家族,著重研究其原核表達(dá)體系,真正獲得的重組抗菌肽活性均低于天然抗菌肽活性,且降低了獲得生物活性肽的幾率;加之原核融合表達(dá)產(chǎn)量低,不符合工業(yè)開發(fā)的要求。在真核表達(dá)過程中,酵母表達(dá)體系以其自身優(yōu)勢更適合工業(yè)開發(fā)與生產(chǎn),家蠅抗菌肽真核異源表達(dá)系統(tǒng)研究已經(jīng)深入所有家族,但現(xiàn)今蠶類抗菌肽中只有Cecropin家族有相關(guān)報道[28-29],因此,蠶類抗菌肽真核異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用更值得關(guān)注。

表1 蠶類抗菌肽異源表達(dá)情況

4 應(yīng)用與展望

蠶類抗菌肽是蠶體對外界病原物侵染而產(chǎn)生的先天免疫產(chǎn)物,其自身具備的特點使它在醫(yī)藥、植物抗病、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等方面得到應(yīng)用。

4.1 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

雖然抗生素的出現(xiàn)為人類的健康做出了許多貢獻(xiàn),但是隨著抗生物的大量使用導(dǎo)致了許多耐藥病原菌的產(chǎn)生;并且抗生素的使用對生物機(jī)體有害,因為它能刺激內(nèi)毒素的釋放,有時還會造成膿毒休克?？咕脑谑褂脮r就無此現(xiàn)象發(fā)生,且它能抑制細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生對人體有害的細(xì)胞因子;抗菌肽具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理,它通過對細(xì)胞膜的物理化學(xué)損傷使細(xì)胞破裂,或者抑制細(xì)胞壁的呼吸而達(dá)到抑制細(xì)菌繁殖的效果。趙東紅等[36]在掃描電鏡下觀察到家蠶抗菌肽CM4對離體U937、Hela癌細(xì)胞骨架及核骨架有明顯損傷作用。柞蠶抗菌肽能抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制,又能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞,對動物安全、無毒副作用,在醫(yī)藥上已制成“腎肝寧”膠囊治療腎炎及肝炎[37]。

4.2 在植物抗病方面的應(yīng)用

1998年,張祥喜等人研究發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽能夠抑制花生青枯病,且花生青枯病病菌的生長速率與家蠶抗菌肽濃度對數(shù)值間呈負(fù)相關(guān)[38]。2008年李波等[39]討論了抗菌肽Cecropin及其在轉(zhuǎn)基因植物抗菌中的應(yīng)用,闡述了轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)Cecropin抗菌肽具有應(yīng)用優(yōu)勢和實用價值。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程,如轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物,產(chǎn)生抗病新品種,使其自身抵制病蟲害的能力增強(qiáng),從而能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的投用,減少了對自然環(huán)境的危害,也為人們提供了健康的綠色食品。

4.3 在食品工業(yè)方面的應(yīng)用

目前我國使用的食品防腐劑多以苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對羥基苯甲酸脂類等化學(xué)合成劑為主,這些防腐劑在食品加工中的添加量都較大,容易超標(biāo)而危害人體健康;蠶類抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好和水溶性好等特點,將它作為食物加工及保存的添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景[40]。抗菌肽在食品發(fā)酵方面也有重要的應(yīng)用,它能用于防止食品發(fā)酵過程中的雜菌污染,除了直接添加這類肽以外,還可以把抗性基因轉(zhuǎn)入發(fā)酵菌株,讓發(fā)酵菌株表達(dá)這類抗菌肽以防止雜菌污染。

4.4 在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用

抗菌肽在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在抗菌肽作為飼料添加劑。目前,抗生素應(yīng)用導(dǎo)致大量抗性菌產(chǎn)生,使得抗生素在此領(lǐng)域的應(yīng)用受到質(zhì)疑。而蠶類抗菌肽作為一種廣譜、高效、綠色的新型抗生素,其應(yīng)用已初現(xiàn)雛形。2010年陳冰等[41]在對蝦飼料中添加家蠅幼蟲抗菌肽提取物,添食實驗說明飼料中添加適量的家蠅抗菌肽對凡納濱對蝦有一定的促生長作用,并能提高對蝦的免疫相關(guān)指標(biāo)。

目前,蠶類抗菌肽還處在試驗和應(yīng)用推廣階段,成熟可靠的研究成果將有助于蠶類抗菌肽的實用化。作為新世紀(jì)抗生素取代藥物之一,綠色、高效、穩(wěn)定的特點將使抗菌肽類產(chǎn)品具有巨大的應(yīng)用潛力。而家蠶絲綢產(chǎn)業(yè)作為中國重要進(jìn)出口產(chǎn)業(yè)之一,蠶類抗菌肽的應(yīng)用也將受到其積極的影響,在新世紀(jì)絲綢之路愈加輝煌的過程中,蠶類抗菌肽藥物也必將倍受重視,在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、食品業(yè)等領(lǐng)域作出巨大的貢獻(xiàn)。

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