基于天然蠶絲及蜘蛛絲蛋白的生物材料研究進展*

趙曉 張袁松 曾崢 吳大洋

(西南大學(xué)紡織服裝學(xué)院,重慶 400716)

絲蛋白(silk protein)是由自然界中的節(jié)肢動物,如蠶、蜘蛛、蝎子等分泌的一種蛋白質(zhì)聚合物。絲蛋白通常是在上皮細胞進行生物合成而得到的,所得到的絲蛋白可存儲于分泌腺的腔體中,進而通過吐絲管或其它導(dǎo)管紡制成纖維,最終得到蠶絲、蜘蛛絲等天然的具有特殊功能的材料[1]。無論是研究及應(yīng)用五千多年的蠶絲還是近十年來成為材料科學(xué)領(lǐng)域研究熱點的蜘蛛絲,均具有較高的彈性、拉伸強度等力學(xué)性能及生物適應(yīng)性能,尤其是機械性能甚至優(yōu)于以高強力著稱的芳綸及尼龍等化學(xué)纖維,其中蠶絲、蜘蛛絲與其他材料的力學(xué)性能比較見表1。由于絲纖維突出的機械性能及生物相容性能,該材料目前已被廣泛應(yīng)用于藥物可控釋放、生物材料及組織工程框架材料。

表1 絲纖維及人造纖維的力學(xué)性能[2]

之所以基于絲蛋白的天然絲纖維材料具有優(yōu)良的力學(xué)及生物適應(yīng)性能,是由其分子結(jié)構(gòu)及成纖過程所決定的。如蠶絲和蜘蛛絲的化學(xué)組成均為蛋白質(zhì),相似的結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)交替排列的結(jié)構(gòu)使其均具有較高的拉伸強度及良好的彈性[3]。除了蠶絲、蜘蛛絲等天然絲纖維的研究外,近年來,基于絲蛋白的其它生物材料也日漸成為材料科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。本文從蠶絲及蜘蛛絲結(jié)構(gòu)與性能研究入手,對近年來基于絲蛋白的生物材料的最新研究進展做一全面的概述,以期揭示材料結(jié)構(gòu)及性能的相關(guān)規(guī)律。

1 基于絲蛋白的天然生物材料

1.1 蠶絲

在所有能生產(chǎn)絲纖維的節(jié)肢動物中,桑蠶絲最具經(jīng)濟價值,其應(yīng)用歷史也可以追溯到幾千年前,而其最初用于生物材料,主要是用作醫(yī)用縫合線,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)及材料開發(fā)技術(shù)的逐漸進步,桑蠶絲也已被廣泛應(yīng)用于許多臨床領(lǐng)域[4]。由于家蠶可大規(guī)模飼養(yǎng),長期以來,其分子結(jié)構(gòu)的研究也已較完善。桑蠶絲具有如圖1所示的核殼結(jié)構(gòu),核層的主要成分為絲心蛋白(fibroin),絲心蛋白主要由3種蛋白質(zhì)成分組成,分別為350kd的H-鏈蛋白、25kd的L鏈蛋白及30kd的P25蛋白,其中H-鏈蛋白∶L鏈蛋白∶P25蛋白的摩爾比為6∶6∶1。H-鏈蛋白為疏水性蛋白質(zhì),主要為絲纖維提供類結(jié)晶結(jié)構(gòu),決定絲線強度;L鏈蛋白為親水性蛋白,彈性相對較強。在絲纖維形成之前,三種蛋白質(zhì)的溶液分別由家蠶的兩個腺體分泌出來,然后由頭部吐絲口噴出,最終所得到的核層絲心蛋白結(jié)構(gòu)為各向異性的以β-折疊為主的納米晶體,并沿纖維軸向排列。絲心蛋白外層由一系列絲膠蛋白組成,以保證絲纖維之間能粘連成為蠶繭。另外如圖1所示,蠶絲的殼層主要由其它蛋白質(zhì)組成,保護蠶繭,使其免受微生物及捕食蠶繭的其它生物侵襲。

如上所述,絲心蛋白的構(gòu)成既含有以β-折疊為主的結(jié)晶區(qū),又有親水性蛋白構(gòu)成的無定形區(qū),這種交替排列的結(jié)構(gòu)使得蠶絲既具有較高的拉伸強度,又具有優(yōu)良的彈性,因此蠶絲可被廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域,下文將著重論及蠶絲纖維在近年來合成生物材料中的廣泛應(yīng)用。

1.2 蜘蛛絲

蜘蛛絲,尤其是由大囊狀腺分泌的蜘蛛拖絲具有非常高的拉伸強度及較好的彈性,與蠶絲類似,蜘蛛絲也具有核殼結(jié)構(gòu)[4,5](圖2)。其中,核層主要為兩種蛋白質(zhì)(MA spidroin,主要為來自于絡(luò)新婦屬蜘蛛(N.clavipes)的MaSp1和MaSp2以及來自于十字園蛛(A.diadematus)的ADF-3H和ADF-4),緊鄰核層的分別為小囊狀腺蛋白質(zhì)層(MI-like spidiroin)、糖蛋白層及最外層的類脂殼層。由于蜘蛛天性的限制,無法大規(guī)模飼養(yǎng),使蜘蛛絲的相關(guān)研究及應(yīng)用滯后于蠶絲,其突出的機械性能近年來得到材料學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域研究者們的關(guān)注,然而由于蜘蛛絲產(chǎn)量并不高(一個完整的蜘蛛網(wǎng)只能紡制出12m蜘蛛絲,而一顆蠶繭能紡制出600～900m蠶絲),目前對于蜘蛛絲的研究著重于通過基因工程技術(shù)來增加蜘蛛絲的產(chǎn)量。

圖1 桑蠶絲的核殼結(jié)構(gòu)[4]

圖2 蜘蛛絲的結(jié)構(gòu)[4]

蜘蛛絲的形成過程如圖3所示,氨基酸重復(fù)單元序列組成的蜘蛛絲蛋白在氫鍵、疏水作用等弱化學(xué)作用力的驅(qū)動下自聚集成β-折疊結(jié)構(gòu)的結(jié)晶體(β-sheet crystals);隨之β-折疊結(jié)構(gòu)進一步自聚集形成膠束(micelles),其中親水端朝向邊緣;隨著蛋白質(zhì)的濃度增加,膠束轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀的液晶態(tài)(Liquid crystals);最后,所形成的亞穩(wěn)態(tài)的液晶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)通過噴絲口,在應(yīng)力作用下進一步牽伸排列形成更穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu),從而使所形成的蜘蛛絲具有超強的拉伸強度。

圖3 蜘蛛絲的形成過程[6]

從目前對于蜘蛛絲的研究現(xiàn)狀來看,開發(fā)多樣化性能,用來設(shè)計及加工新型生物材料是蜘蛛絲最具前景及吸引力的應(yīng)用之一,如已有相關(guān)研究單位將蜘蛛絲用于醫(yī)療器械及組織工程領(lǐng)域[7]。具體的應(yīng)用方式可采用和蠶絲在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的相似的方法,比如,將蜘蛛絲用于干細胞及韌帶細胞的再造。最近也有相關(guān)報道,以大囊狀腺拖絲為原料,人工搜集蜘蛛絲,將其接種于人類的神經(jīng)鞘細胞并進行生物相容性表達,這在未來將是治療神經(jīng)末梢損傷的一種有效的途徑[8]。除了天然的蜘蛛絲蛋白可直接應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之外,借助表面功能化的方法還可賦予蜘蛛絲更多樣化的功能,如在蛛絲蛋白的氨基酸基團表面接枝羧酸等功能基團,從而可以進一步改善蛋白質(zhì)與細胞之間的相互作用,進一步拓寬了蜘蛛絲在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

2 基于絲蛋白的合成生物材料

絲蛋白在水、有機溶劑及離子液體中具有一定溶解度,因此,除了上文所述的蠶絲、蜘蛛絲等天然絲蛋白可用作生物材料之外,還可用人工的方法,將絲蛋白在體外進行合成,并賦予其特殊的性能,制作成新型的生物材料,包括納米纖維、薄膜、水凝膠、多孔海綿、微球及微膠囊等(見圖4),最終可應(yīng)用于藥物可控釋放、組織工程框架等材料[4,6]。

2.1 不同形貌及結(jié)構(gòu)的基于絲蛋白的人工合成生物材料

在人工合成絲蛋白的過程中,需先將天然絲蛋白溶解,再通過環(huán)境因素的控制,獲取具有不同形貌的材料。研究發(fā)現(xiàn),對材料最終結(jié)構(gòu)及形貌影響顯著的環(huán)境因素包括溶劑類型、pH值、蛋白質(zhì)濃度、離子濃度及溫度等,這些環(huán)境因素的改變,直接影響絲蛋白β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分布及最終所形成材料的形貌與性能,下文將針對目前研究較多的幾種不同形貌的基于絲蛋白的人工合成材料進行綜合概述。

圖4 基于絲蛋白的合成生物材料

2.1.1 纖維

從仿生學(xué)的角度來看,將天然絲蛋白加工制作成纖維狀材料可模仿蠶絲及蜘蛛絲的成纖過程,即蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過噴絲口再牽引拉伸成型的過程。事實上,目前所采用的方法也確實是模仿蠶及蜘蛛吐絲的方法,通過濕法紡絲、手工牽引、靜電紡絲或借助微流控制器的方法等[4],將天然絲蛋白紡制成纖維。

以蠶絲蛋白為例,在加工蠶絲蛋白纖維時,先將絲蛋白溶于溴化鋰(LiBr)或N-甲基嗎啉氧化物(NMMO)水溶液中,然后輕度拉伸處理30min,水洗、空氣烘干制得纖維[9-10]。使用該方法制得的蠶絲纖維機械性能較差,與天然蠶絲纖維相比質(zhì)地較脆。近年來,采用靜電紡絲的方法制作的蜘蛛絲纖維被認(rèn)為是一種有應(yīng)用前景的加工方法。將通過基因工程技術(shù)表達的蜘蛛絲蛋白(MaSpⅠ蛋白)置于含有Tris緩沖液及鹽的尿素中制得紡絲原液,然后通過靜電紡絲法制得蜘蛛絲纖維,所得到的成品直徑約在10～60μ m,分子取向及機械性能與天然的蜘蛛絲相當(dāng)[11]。

2.1.2 薄膜

將合成的蜘蛛拖絲蛋白ADF-3及ADF-4溶于六氟異丙醇(HFIP)溶液中,則可得到厚度為0.5～1.5μ m的透明薄膜狀材料,通過添加磷酸鉀及甲醇等,還可將蛛絲蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊,從而制得疏水薄膜[12-13]。另外通過基因克隆技術(shù),還可對薄膜表面進行功能化處理,從而使所得到的材料廣泛用作創(chuàng)傷敷料及固定化酶框架材料。

2.1.3 水凝膠及多孔海綿

在合成的蜘蛛拖絲蛋白ADF-4中添加甲醇,蜘蛛絲會自聚集形成直徑為3nm左右,長度不少于1μ m的納米纖維,數(shù)天之后,這些納米纖維回轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂欣w維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠,所形成的水凝膠為一種非線性粘彈性材料,其強度及剛度相對較低。而用該方法得到的水凝膠還可以進一步交聯(lián),使材料的模量和強度有較大程度的提高,并能用來制作具有多孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的組織框架材料[14]。另外,蠶絲及蜘蛛絲均還可用來制作多孔的三維海綿狀材料,其方法為,將絲蛋白溶于混有鹽及甲醇的溴化鋰溶液中,經(jīng)處理后得到海綿狀材料[15]。所得到三維海綿材料在組織工程領(lǐng)域有極其重要的應(yīng)用價值,可作為框架起到支撐細胞、運送養(yǎng)及代謝廢物的作用,從而促進組織發(fā)育。

2.1.4 微球及微膠囊

通過控制絲蛋白,如ADF-4蛛絲蛋白,在油水界面的聚集行為,可得到β-折疊結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)的薄的聚合物殼,最終形成殼的厚度為50nm左右,直徑為1～30μ m的絲蛋白聚合物微球或空心微膠囊[16]。由于所得到的微膠囊殼層主要為β-折疊結(jié)構(gòu)的絲蛋白,因此具有較強的機械性能,另外其可降解性能也很容易控制,因此,在藥物可控釋放及微反應(yīng)器設(shè)計方面具有極好的應(yīng)用前景。

2.2 絲蛋白與其他材料合成的生物材料

如上文所述,天然絲蛋白可通過人工合成的方法得到具有不同形貌的生物材料,此外,通過與其它材料合成的方法,還可以得到功能多樣化的生物材料。近年來研究較多的著重于絲蛋白與有機聚合物及無機納米顆粒合成材的生物材料的研究,下面也將對其研究進展作一概述。

2.2.1 絲蛋白與有機聚合物合成的生物材料

目前基于絲蛋白與有機聚合物的新型材料種類繁多,本文著重概述絲蛋白與更具有應(yīng)用前景的可降解有機聚合物合成的生物材料的相關(guān)研究。

聚天冬氨酸(Poly(aspartic acid))和桑蠶絲復(fù)合可制得泡沫材料,具體方法為將桑蠶絲蛋白與聚天冬氨酸的混合物置于加有氯化鈉的容器中,室溫下放置24h,經(jīng)水洗后形成β-折疊結(jié)構(gòu)為主的多孔材料,孔徑為750μ m左右[17],通過這種方法形成的復(fù)合材料在生物礦化領(lǐng)域具有極有利的應(yīng)用空間。

聚己內(nèi)酯(Poly(ε-caprolactone))是經(jīng)美國食品及藥品管理局(FDA)認(rèn)證的一種可生物降解的聚合物。將天然桑蠶絲與聚己內(nèi)酯通過熔融混合的方法可加工制作成薄膜狀材料,所得到的薄膜材料含有的絲纖維組分約為35%～45%,因此具有優(yōu)良的機械性能。另外,最近的研究還發(fā)現(xiàn),利用電子束對所形成的復(fù)合生物材料作用,所產(chǎn)生的自由基還可以促使聚合物鏈段之間的交聯(lián),從而進一步改善材料的拉伸強度[18]。

聚乳酸(polylactic acid)是一種在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用及其廣泛的可降解聚合物,將聚乳酸與蠶絲蛋白復(fù)合可加工制作成薄膜、泡沫及纖維狀復(fù)合生物材料[19]。此外,絲蛋白還可與多種可降解聚合物包括聚氨酯丙烯酸酯、聚乳酸聚乙二醇酸及多種生物聚合物包括酶、絲心蛋白等進行復(fù)合制備既具有優(yōu)良的機械性能又具備生物降解性能的復(fù)合生物材料。

2.2.2 絲蛋白與無機納米顆粒合成的生物材料

與有機聚合物相比,無機納米顆粒以其獨特的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)及磁學(xué)性能,近年來吸引了研究者們的廣泛關(guān)注,利用有機絲蛋白與無機納米顆粒復(fù)合的方法更是可以制備出在生物化學(xué)、生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力的復(fù)合生物材料。絲蛋白與無機納米顆粒的復(fù)合工藝非常簡單,可直接將無機納米顆粒溶膠與絲蛋白溶液混合攪拌而得。目前研究較多的基于絲蛋白與無機納米顆粒合成的材料包括桑蠶絲蛋白與銀、金、過渡金屬納米顆粒及納米二氧化鈦、二氧化硅的復(fù)合材料的制作[4]。與純的蠶絲相比,所制作的復(fù)合生物材料的性能得到不同程度的改善,如采用蠶絲與銀納米顆粒制作的纖維或薄膜表現(xiàn)出抗菌性能的改善,而桑蠶絲與金納米顆粒制作的纖維表現(xiàn)出更好的導(dǎo)電性等,從而有利于基于絲蛋白生物材料的應(yīng)用領(lǐng)域的進一步拓展。

[1]Altman G H.,Diaz F.,Jakuba C.,Calabro T.,Horan R L.,Chen J S.,Lu H L.,Richmond J.,Kaplan D L.Silk-based biomaterials[J].Biomaterials.2003,24:401-416.

[2]Hardy J G.,Scheibel T R.Composite materials based on silk proteins[J].Progress in Polymer Science.2010,doi:10.1016/j.progpolymsci.2010.04.005.

[3]彭衛(wèi)平.蠶絲和蜘蛛絲蛋白基因結(jié)構(gòu)極其表達[J].蠶業(yè)科學(xué).1998,24(4):231-243.

[4]Hardy J G.,R?man L M.,Scheibel T R.Polymeric materials based on silk proteins[J].Polymer.2008,49:4309-4327.

[5]Poza P.,Rigueiro J P.,Elices M.LLorca J.Fractographic analysis of silkworm and spider silk[J].Engineering Fracture Mechanics.2002,69:1035-1048.

[6]Kluge J A.,Rabotyagova O.,Leisk G G.,Kaplam L.Spider silks and their applications[J].Trends in Biotechonology.2008,26(5):244-252.

[7]Altman,G H.et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J].Biomaterials.2002,23:4131-4141.

[8]Allmeling,C.et al.Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine.2006,10:770-777.

[9]Sofia,S.et al.Functionalized silk-based biomaterials for bone formation[J].Journal of Biomeidical Materials.2001,54:139–148.

[10]Xu,Y.et al.Studies on spinning and rheological behaviors of regenerated silkfibroin/N-methylmorpholine-N-oxide H2O solutions[J].Journal of Materials Science.2005,40:5355-5358.

[11]Arcidiacono,S.et al.Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks[J].Macromolecules.2002,35:1262-1266.

[12]Huemmerich,D.et al.Processing andmodification of filmsmade from recombinant spider silk proteins[J].Applied Physics A 2006,82:219-222.

[13]Junghans,F.et al.Preparation and mechanical properties of layers made of recombinant spider silk proteins and silk from silkworm[J].Applied Physics A 2006,82:253-260.

[14]Rammensee,S.et al.Rheological characterization of hydrogels formed by recombinantly produced spider silk[J].Applied Physics A 2006,82:261-264.

[15]Gellynck,K.et al.Chondrocyte growth in porous spider silk 3D-scaffolds[J].European Cells and Materials Journal.2005,10(Suppl.2):45.

[16]Hermanson,K.D.et al.Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk[J].Advance Materials.2007,19:1810-1815.

[17]Kim H J,Kim U J,Kim H S,Li C M,Wada M,Leisk G G,et al.Bone tissue engineering with premineralized silk scaffolds[J].Bone 2008,42:1226-1234.

[18]Qiao X Y,Li W,Sun K,Xu S,Chen X D.Nonisothermal crys-tallization behaviors of silk-fibroin-fiberreinforced poly(epsilon-caprolactone)biocomposites[J].Journal of Applied Polymer Science.2009,111:2908-2916.

[19]Zhu H L,Feng X X,Zhang H P,Guo Y H,Zhang J Z,Chen J Y.Structural characteristics and properties of silk fibroin/poly(lactic acid)blend films[J].Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition 2009,20:1259-1274.