線粒體在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的作用

戴蜜蜜，葛紅山，呂杰強

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟是一個從量變到質(zhì)變的復(fù)雜過程，需經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)成熟和細(xì)胞核成熟才具備受精和進(jìn)一步發(fā)育的能力。作為細(xì)胞質(zhì)中含量最豐富的細(xì)胞器和細(xì)胞的“供能中心”，線粒體在卵子成熟及其后胚胎發(fā)育的過程中發(fā)揮了極其重要的作用。伴隨卵泡發(fā)育進(jìn)程，卵子線粒體發(fā)生了許多特征性的變化，影響和左右著卵子成熟及其后的胚胎發(fā)育。隨著胚胎學(xué)和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，線粒體與卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育之間的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注，現(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 線粒體與線粒體基因組

線粒體一般呈粒狀或桿狀，但因生物種類和生理狀態(tài)而異，可呈環(huán)形、線狀、分叉狀或其他形狀，其在卵子成熟的過程中形態(tài)亦有所變化。電鏡下線粒體由內(nèi)外兩層膜封閉，包括外膜、內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)四個功能區(qū)。內(nèi)膜向線粒體基質(zhì)褶入形成嵴，嵴上有基粒。基質(zhì)為內(nèi)膜和嵴包圍的空間，參與三羧酸循環(huán)的酶類均位于基質(zhì)中，基質(zhì)中還含有纖維絲和電子密度很大的致密顆粒狀物質(zhì)，內(nèi)含 Ca2+、Mg2+、Zn2+等離子。

人類線粒體基因組DNA（mtDNA）是一個16569bp的雙鏈閉合環(huán)狀分子，編碼22種tRNA，2種rRNA和13種蛋白質(zhì)，這13種蛋白質(zhì)都是呼吸鏈酶復(fù)合物的成分，與核DNA編碼生成的多肽一起參與氧化磷酸化。mtDNA可以獨立于核DNA之外進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯[1]。與核DNA不同，mtDNA缺乏組蛋白的保護和必要的修復(fù)機制，且處于高自由基的環(huán)境中，因而突變率遠(yuǎn)較核DNA高[2]。

線粒體是母系遺傳的細(xì)胞器，人類受精卵中的線粒體幾乎全部來自卵細(xì)胞。線粒體從母親傳遞到子代數(shù)量銳減，這就是所謂的“遺傳瓶頸效應(yīng)”，可導(dǎo)致新基因型的快速分離并影響生殖能力[2]。

2 卵母細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)

與體細(xì)胞不同，卵母細(xì)胞線粒體DNA呈單拷貝狀，mtDNA拷貝數(shù)可以反映卵母細(xì)胞線粒體的數(shù)量[3]。卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)高度可變，在人類尤為明顯，人卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)變化范圍為20000～598000，平均193000。mtDNA在卵母細(xì)胞生長、成熟過程中不斷復(fù)制，從最初不足10個至卵子成熟后20000～500000個[4]。卵母細(xì)胞成熟后（MII期）mtDNA復(fù)制停止，直至囊胚期才恢復(fù)，因此在受精前貯備充足數(shù)量的線粒體對卵子受精和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。而外源補充（體外注入）大量新鮮、高活力的線粒體可以提高卵子受精和胚胎種植率[5]。

許多研究表明：mtDNA 拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞的受精和早期胚胎發(fā)育潛能有著重要關(guān)聯(lián)。Santos等[3]研究顯示正常受精的人卵母細(xì)胞內(nèi)mtDNA平均拷貝數(shù)為250454±29730，受精失敗的卵母細(xì)胞內(nèi)mtDNA平均拷貝數(shù)為163698±20192，提示mtDNA含量可反映卵母細(xì)胞的質(zhì)量和受精結(jié)局。另外，卵巢功能的好壞對mtDNA的拷貝數(shù)亦有影響，May-Panloup等[6]研究表明卵巢功能不全的卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)平均只有100000±99000，遠(yuǎn)低于卵巢功能正常組卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)（317000±184000），提示卵巢功能不全的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能低下可能與其mtDNA拷貝數(shù)低下有關(guān)。卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)亦會隨年齡的增長而退化，高齡婦女卵母細(xì)胞發(fā)育潛能差可能是由于卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)下降，或者mtDNA轉(zhuǎn)錄水平下降所致[7]。

3 線粒體在卵母細(xì)胞成熟過程中的分布情況

線粒體在卵母細(xì)胞中的分布具有階段性，卵母細(xì)胞成熟前后線粒體分布發(fā)生了明顯的變化。劉姍等[8]研究顯示人卵母細(xì)胞體外成熟前后，線粒體分布由未成熟卵母細(xì)胞中以周邊分布為主變?yōu)槌墒炻涯讣?xì)胞中以均勻分布為主。對小鼠卵子的研究還發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟過程中，線粒體的核周聚集是細(xì)胞質(zhì)成熟的一部分，缺乏線粒體核周聚集導(dǎo)致了卵子成熟阻滯[9]。

卵母細(xì)胞成熟過程中，不同階段線粒體分布不同，因此線粒體的分布是評價卵子和早期胚胎發(fā)育潛能的重要參數(shù)[10]。缺乏線粒體在胞質(zhì)中的重新分布往往標(biāo)志著細(xì)胞質(zhì)未成熟，這與卵子發(fā)育潛能低密切相關(guān)。線粒體準(zhǔn)確的分布為微管活動提供了能量保證，有助于減數(shù)分裂過程中染色體的正常分離，否則可能導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，引起非整倍體的增加[11]。

4 線粒體膜電位與卵母細(xì)胞成熟、早期胚胎發(fā)育

線粒體膜電位是細(xì)胞活性的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它反映了電子傳遞和氧化磷酸化過程中質(zhì)子的轉(zhuǎn)運。線粒體的許多功能，包括蛋白質(zhì)運輸、ATP產(chǎn)生和脂質(zhì)生成，都依賴膜電位的維持[12]。正常情況下，線粒體高極化狀態(tài)（膜電位較高），有助于線粒體產(chǎn)生ATP。發(fā)育潛能好的卵子線粒體膜電位比發(fā)育潛能差的膜電位高[10]。

線粒體膜電位的高低影響氧化代謝水平，若線粒體內(nèi)膜受到損害引起膜電位降低，導(dǎo)致氧化代謝水平下降，不能產(chǎn)生足夠的ATP，可對卵子成熟、受精和胚胎發(fā)育結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，早期胚胎發(fā)育阻滯可能與成熟卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體活性低下有關(guān)。膜電位還與鈣離子動態(tài)平衡的調(diào)控有關(guān)。Van Blerkom等[13]認(rèn)為，MII期卵高極化線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均位于胞質(zhì)周邊，可能參與游離鈣離子的局部調(diào)節(jié)。Jones等[14]比較新鮮收集的人MII期卵與冷凍保存的人MII期卵后發(fā)現(xiàn)，凍存人MII期卵細(xì)胞質(zhì)周邊線粒體極化喪失，低溫冷凍會損傷MII期卵線粒體活性，解凍后的卵子釋放游離鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的能力減弱。

異常線粒體低膜電位可導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，引起植入前胚胎鑲嵌紊亂[15]。研究發(fā)現(xiàn)，高極化和低極化線粒體的比率可反映卵母細(xì)胞內(nèi)異常的線粒體分布和胚胎的代謝缺陷，并影響卵子體內(nèi)、體外受精能力[16]。線粒體高低極化的比率亦與IVF后胚胎卵裂的碎片率有關(guān)[17]。

新近研究表明[18]，卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的NO可作為調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)線粒體膜電位的高低，主要為抑制作用，卵泡內(nèi)的低氧環(huán)境能加強這種抑制作用。NO和O2的比例高低是否會影響卵胞漿內(nèi)線粒體的極性還有待于進(jìn)一步研究。

5 mtDNA突變對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響

線粒體是極其敏感的細(xì)胞器，卵母細(xì)胞成熟過程中體內(nèi)外環(huán)境的變化均可影響mtDNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。mtDNA缺乏組蛋白的保護和必要的自我修復(fù)能力，且處于高自由基的環(huán)境中，因此極易發(fā)生結(jié)構(gòu)突變。另外因mtDNA的基因排列得非常緊湊（幾乎不含內(nèi)含子），任何突變都可能累及基因組的重要功能區(qū)，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。突變所產(chǎn)生的效應(yīng)取決于該細(xì)胞中野生型和突變型線粒體DNA的比例，只有突變型DNA達(dá)到一定數(shù)量（閾值）才足以引起細(xì)胞的功能障礙，這種現(xiàn)象稱為“閾值效應(yīng)”。mtDNA突變類型多達(dá)150多種，包括缺失、插入、重復(fù)等，最常見的是mtDNA 4977 bp缺失（也稱普通缺失）。mtDNA 4977 bp缺失與卵子衰老、低受精能力、發(fā)育阻滯及死亡有關(guān)[19]。人卵母細(xì)胞mtDNA 4977 bp缺失頻率為32.8%，胚胎為8%。在未受精的卵母細(xì)胞中mtDNA 4977 bp缺失率顯著增加，可達(dá)70%以上，高齡及某些不孕婦女比例更高[6]。mtDNA 4977 bp缺失的累積可導(dǎo)致ATPase6、ATPase8、細(xì)胞色素氧化酶III和NADH-CoQ等氧化還原酶類基因缺失，從而引起線粒體功能障礙和ATP產(chǎn)生受損，且會干擾卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育[20]。Gibson等[21]檢測獼猴MII卵發(fā)現(xiàn)其mtDNA缺失主要是5740 bp缺失，且這種缺失與獼猴年齡及體外受精結(jié)局有相關(guān)性。

Lorraine等[22]利用高效液相色譜技術(shù)分析26個人卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)8個卵母細(xì)胞存在14種點突變，都是A-G突變或T-C突變。這些突變的分布呈現(xiàn)隨機性，并表現(xiàn)出不同水平的異質(zhì)性（<5%～50%）。他們猜測，這些突變可能在卵母細(xì)胞發(fā)育早期發(fā)生，可增加兒童期氧化磷酸化酶系疾病的風(fēng)險。mtDNA點突變累積呈現(xiàn)年齡依賴性，一種T414G突變在26～36歲病人的卵子中發(fā)生率為4.4%，而在37～42歲病人的卵子中發(fā)生率為39.5%，兩者差異有顯著性。這種突變存在于mtDNA調(diào)控區(qū)，可能在卵子成熟及其后胚胎發(fā)育的過程中影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

外源激素刺激也可造成卵子mtDNA 4977 bp缺失率增加，未受外源激素刺激的卵母細(xì)胞4977 bp缺失率為21.3%，而接受刺激作用的卵母細(xì)胞4977 bp缺失率達(dá)71.4%。另外，未受外源激素刺激的卵母細(xì)胞與成熟卵母細(xì)胞、胚胎以及受精失敗的卵子相比，4977 bp缺失率差異存在顯著性[21]。

6 線粒體產(chǎn)生ATP為卵母細(xì)胞成熟提供能量來源

ATP為卵母細(xì)胞成熟、受精、胚胎發(fā)育等提供能量保證，線粒體的氧化磷酸化過程是產(chǎn)生ATP的主要方式。卵子發(fā)生時線粒體復(fù)制和ATP累積對遠(yuǎn)期發(fā)育成熟至關(guān)重要[10]。所以，ATP含量可以作為卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育潛能的標(biāo)志之一，未成熟卵的ATP含量明顯低于成熟卵，ATP含量低的未成熟卵，其成熟后受精率也低。

卵子紡錘體的形成需要正常的線粒體功能，減數(shù)分裂中期，線粒體為紡錘體形成、染色體分離提供能量，如果線粒體功能異常造成ATP產(chǎn)生不足，就可能影響紡錘體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生[23]。氧化應(yīng)激時線粒體損傷，產(chǎn)生ATP不足，導(dǎo)致紡錘體形態(tài)損傷[8]。

使用外源促性腺激素能改變卵子線粒體的能量生產(chǎn)。Lee等[24]的研究顯示，注射15 IU hCG或15 IU hCG和15 IU PMSG的金色倉鼠的卵子ATP水平顯著高于對照組。過量促性腺激素則可能使ATP產(chǎn)生過量或使抑制ATP產(chǎn)生的底物缺乏，造成ATP產(chǎn)生達(dá)到有害水平，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

來自卵母細(xì)胞線粒體移植的研究證實，將年輕婦女的卵母細(xì)胞線粒體移植入老齡婦女的卵子胞漿，后者的ATP含量會明顯升高，并改善了其卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育能力[25]。

7 展望

探索IVF/ET過程中卵子和胚胎高損失率的機制是當(dāng)前和今后人類ART和胚胎學(xué)研究的焦點之一。隨著對線粒體研究的深入，線粒體含量、空間分布、mtDNA拷貝數(shù)、膜電位及其產(chǎn)生的ATP對卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育的影響逐漸為人們所了解。鑒于線粒體在卵子發(fā)育成熟及早期胚胎發(fā)育過程中的變化和作用，我們有理由相信線粒體與ART周期中卵子/胚胎的高損失率間存在著某些重要關(guān)聯(lián)，因此開展更多更廣泛的相關(guān)研究，以進(jìn)一步了解線粒體在生殖過程中的作用，具有重要的研究和臨床意義。

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