氯沙坦對兔腹主動脈內(nèi)皮損傷后過氧化物酶體增殖物激活受體-γ與纖溶酶原激活物抑制因子-1表達的影響

劉 慧,高傳玉,李海劍,李玉東,楊守忠,毛紹芬,陶雅非

1)河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科鄭州 450003 2)南陽市中心醫(yī)院心內(nèi)科南陽 473009 3)南陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科南陽 473009 #通訊作者,男,1962年生,博士,主任醫(yī)師,研究方向:冠心病的診斷與治療,E-mail:gaocy2000@yahoo.com.cn

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)是甾體激素受體超家族的新成員,能被脂肪酸以及外源性過氧化物增殖物激活,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究[1-3]表明,PPARγ具有整體的抗炎癥和抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)功能。作為臨床上廣泛應(yīng)用的血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(AT1R)拮抗劑氯沙坦,其抗AS作用是否與PPARγ有關(guān),目前未見報道。作者建立了兔腹主動脈 AS模型,觀察氯沙坦對血管成形術(shù)后PPARγ和纖溶酶原激活物抑制因子-1(p lasm inogen activator inhibitor-1,PAI-1)表達的影響,以進一步探討氯沙坦對AS和斑塊穩(wěn)定作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 新西蘭大白兔24只,雄性,體質(zhì)量(2.5±0.3)kg,河南省實驗動物中心提供。隨機分為普通飼料喂養(yǎng)組(G1組)、高脂飲食喂飼+動脈內(nèi)皮損傷組(G2組)及高脂飲食喂飼+動脈內(nèi)皮損傷+氯沙坦治療組(G3組),每組8只。

1.2 試劑及儀器 PPARγ、PAI-1一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。球囊由Cordis公司提供。日本HMIS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)。1.3 動物模型的建立 G1組家兔喂以普通飼料。G2、G3組家兔以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%膽固醇的飼料飼養(yǎng)2周后行腹主動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)。參考 Block等[4]的方法并加以改進,制作腹主動脈球囊損傷模型。術(shù)后G2、G3組繼續(xù)以高脂飲食喂養(yǎng) 6周,G3組每天加用氯沙坦(商品名科素亞,美國默沙東公司提供)10 mg/kg。

1.4 組織標(biāo)本留取 術(shù)后6周處死各組家兔,取出腹主動脈,截取成形部位血管標(biāo)本,4 g/L多聚甲醛固定 4 h。逐級脫水,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,采用電腦圖像分析儀分別測定新生內(nèi)膜厚度(intimal thickness,IT)、中膜厚度(media thickness,MT)、內(nèi)膜面積(intimal area,IA)及中膜面積(media area, MA),計算新生內(nèi)膜厚度與中膜厚度比(IT/MT)及內(nèi)膜面積與中膜面積比(IA/MA)。

1.5 腹主動脈PPARγ和PAI-1蛋白檢測 PPARγ

及PAI-1免疫組織化學(xué)染色采用常規(guī)親和素-生物素-過氧化物酶技術(shù),具體步驟參照試劑盒說明書。PPARγ、PAI-1陽性著色均表現(xiàn)為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或棕褐色。每張切片高倍鏡下取 10個視野,計算每個視野下陽性表達的血管平滑肌細(xì)胞占總血管平滑肌細(xì)胞的百分比,結(jié)果取平均值。

1.6 腹主動脈PPARγ和PAI-1mRNA檢測 組織總RNA提取按Trizol說明書進行。RT-PCR采用兩步法。10μg總RNA配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,25℃10min,42℃60 min,70℃10min,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板用PPARγ、PAI-1引物經(jīng)PCR方法進行擴增,反應(yīng)總體積為 25μL。引物由北京奧科公司合成。PPARγ引物序列:上游5'-CACAA GAACAAATGCCAGTA-3',下游5'-GGTCCTCAGTG GAAGAATCG-3';PAI-1引物序列:上游5'-TGG ACTTGACCACGGAGGAGC-3',下游5'-CTCGGTG CCCTTCAGTGAGCT-3';內(nèi)參照β-actin引物序列:上游5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3',下游5'-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3'。PPARγ擴增條件為:95℃5 min;94℃30 s,63℃50 s,72℃30 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸6min,終產(chǎn)物為521 bp。PAI-1擴增條件為:95℃5m in;94℃30 s,59℃40 s,72℃40 s,共 35個循環(huán);最后72℃延伸6 min,終產(chǎn)物為480 bp。β-actin終產(chǎn)物為332 bp。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用圖文分析系統(tǒng),以目的基因片段/β-actin片段的條帶灰度值比值來表示其相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0對3組腹主動脈IT、IT/MT比值、IA、IA/MA比值、PPARγ和PAI-1蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量行單因素方差分析及SNK-q檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組腹主動脈IT、IT/M T、IA及IA/MA比值的比較 結(jié)果見表1。

表1 3組腹主動脈IT、IT/MT比值、IA及IA/M A的比較

2.2 3組腹主動脈PPARγ和PAI-1蛋白的表達 結(jié)果見圖1、圖2及表2。

表2 3組腹主動脈PPARγ及PAI-1蛋白陽性表達率和m RNA相對表達量的比較

2.3 3組腹主動脈PPARγ及PAI-1 mRNA的表達 結(jié)果見表2、圖3和圖4。

圖3 3組腹主動脈PPARγm RNA的RT-PCR結(jié)果

圖4 3組腹主動脈PAI-1m RNA的RT-PCR結(jié)果

3 討論

AS是多種病因造成的始發(fā)于動脈壁內(nèi)膜的一系列分子和細(xì)胞改變的結(jié)果。PPAR屬Ⅱ型核受體超家族成員,可在AS斑塊處表達,在AS有關(guān)的脂質(zhì)代謝和血管炎癥中起關(guān)鍵作用[3]。該研究中,兔腹主動脈內(nèi)皮損傷后,局部PPARγ表達增加,提示內(nèi)皮損傷可以刺激 PPARγ過度表達。在相應(yīng)配體的作用下, PPAR可以下調(diào)某些致病基因的表達。研究[5]表明, PPARγ激動劑能夠通過抗炎、抗氧化、保護內(nèi)皮細(xì)胞、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及穩(wěn)定斑塊等多種途徑,從整體上發(fā)揮抗AS作用。

近年發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)除了降壓以外,還具有抗纖維化、抗卒中、降尿酸、抗房顫(AF)、治療舒張期心力衰竭及抗AS等[6]多種作用。其中僅有替米沙坦被證實是PPARγ的一種部分激動劑,通過激活PPARγ發(fā)揮抗AS作用[7]。而目前廣泛應(yīng)用的氯沙坦的抗 AS作用是否與PPARγ有關(guān),尚未見報道。

PAI-1是體內(nèi)最重要的纖溶活性調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)纖溶平衡[8]。PAI-1致AS的主要機制是阻止纖溶酶形成及細(xì)胞外基質(zhì)的降解,調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,有助于形成阻塞性斑塊而導(dǎo)致臨床事件發(fā)生。該研究中,球囊拉傷動脈導(dǎo)致PAI-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞過度表達。PAI-1異常表達所致的細(xì)胞表面纖溶活性降低可引起或加重血栓形成。

總之,該研究建立了兔腹主動脈 AS模型,觀察氯沙坦對血管成形術(shù)后PPARγ和PAI-1表達的影響。結(jié)果表明,兔腹主動脈內(nèi)皮損傷,發(fā)生 AS后,局部 PAI-1表達異常升高,與國外相關(guān)研究[9]一致,給予氯沙坦干預(yù)后明顯下降,同時 PPARγ表達增加。有研究[10]表明,PPARγ激活后可以抑制PAI-1表達。該研究結(jié)果表明,氯沙坦抑制PAI-1表達,抗AI,可能與激活PPARγ有關(guān),但其具體機制及信號途徑有待進一步研究。

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