豬腦心肌炎病毒的分離與鑒定*

張嶺嶺,王金鳳,王 嬌,趙澤坤,孫繼國,袁萬哲

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科學院,保定071000)

腦心肌炎病是由腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)引起豬及多種哺乳動物腦炎、心肌炎以及心肌周圍炎的一種急性傳染病。該病也是一種人畜共患病,不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,也危害了人類的健康。腦心肌炎病毒屬于微RNA病毒科心病毒屬,是有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。此病毒最先是1945年從佛羅里達州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內(nèi)分離得到[2],隨后研究發(fā)現(xiàn)該病毒感染牛、大象、烷熊、袋鼠、拂拂、稱猴、猩猩、非洲綠猴、松鼠、長頸鹿甚至蚊子等多種動物[3-7],一般呈隱性感染。1985年,巴拿馬首次報道EMCV能夠感染豬并引起豬急性致死性心肌炎[8]。隨后,在意大利、希臘、塞浦路斯、比利時、法國、英國等國也報道了該病的暴發(fā)流行[9-11]。我國對EMCV的研究起步較晚,EM CV感染在我國豬群中已廣泛存在,僅2001年—2004年間的抗體陽性率就已達75.84%[12],這應引起國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的高度重視。本試驗采用無EMCV污染的BHK-21細胞,對保定市發(fā)生的具有EMCV典型臨床癥狀和剖檢特征,并將PCR檢測為陽性的病料進行了EMCV毒株的分離和鑒定,以期獲得EMCV河北地方流行毒株,從而為探索EMCV的流行病學數(shù)據(jù)、相關疾病的致病機理、篩選疫苗毒株和制定綜合防控措提供依據(jù)。本試驗成功分離到1株EMCV,將其命名為BD2株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病料采自河北省養(yǎng)豬場EMCV疑似病死仔豬的脾臟及淋巴結。

1.1.2 細胞系 BHK-21細胞由河北農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)衛(wèi)生檢驗實驗室保存、提供。

1.1.3 主要試劑 新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品,56℃滅活30 min,置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10×DMEM濃縮液:將GIBCOTM DMEM(Invitrogen Corporation,NY,USA)粉劑按廠家說明書配制,過濾除菌,4℃保存,使用時進行10倍稀釋。

2×104 U/mL青霉素鏈霉素液(雙抗):青霉素、鏈霉素各2×106單位溶于100 mL三蒸水中,過濾除菌,分裝后,—20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

500 mmol/L Hepes貯存液:1.2 g Hepes溶于10 mL三蒸水中,經(jīng)121℃高壓滅菌15 min,置—20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

75 g/L NaHCO3:7.5 g NaHCO3溶于100 mL三蒸水中,115℃高壓滅菌20 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10×Na2EDTA-胰酶溶液(25 g/L):Na2EDTA 0.2 g,NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4°12H2O 2.89 g,KH2PO4 0.2 g,溶于90 mL三蒸水中,再加入2.5 g胰酶(Amresco Inc.)(1∶250),完全溶解后,加三蒸水補足至100 mL,NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4,過濾除菌,分裝,置—20℃保存?zhèn)溆?使用時1∶10稀釋。

100 mL/L FBS DMEM培養(yǎng)基:于264 mL三蒸水中加入80 mL 5×DMEM溶液,40 mL FBS,2 mL 2×104U/mL

青鏈霉素液,4 mL 500 mmol/L Hepes貯存液,用75 g/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4左右,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

無FBS DMEM培養(yǎng)基:于304 mL三蒸水中加入80 mL 5×DMEM溶液,2 mL 2×104U/mL青鏈霉素液,4 mL 500 mmol/L Hepes貯存液,用75 g/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4左右,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA提取試劑TRIZOL、Marker:購自天根生物試劑有限公司

RNA酶抑制劑(RNasin)、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反轉錄酶AMV Reverse Transcriptase:購自北京全式金生物科技公司。

10 mg/mL EB貯存液:實驗室保存。

50×TAE(T ris-HCl):實驗室保存。

10 g/L瓊脂糖凝膠電泳:稱取1.0 g瓊脂糖溶于100 mL 1×TAE電泳緩沖液中,溶化后加入5 mL 10 mg/mL EB。

貯存液:使凝膠中EB終濃度達到0.5 mg/mL。

1.1.4 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱;Forma Scientific;倒置顯微鏡:日本Nikon;超凈工作臺:蘇州凈化設備廠;臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;高速冷凍離心機:GIBCO公司。;DYYIII-31 A/31 B型電泳槽:北京六一儀器廠;DYYIII-2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠;Kodak凝膠成像分析系統(tǒng):天能科技(上海)有限公司。

微孔細胞培養(yǎng)板:Costar公司

1.1.5 引物的設計 根據(jù)已發(fā)表的EMCV基因組全序列(GenBank收錄號:X74312),利用計算機輔助軟件Primer5.0設計特異性引物P1/P2預期擴增長度為300 bp,均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 無菌采集病變組織2 g,加入3 mL滅菌PBS,在冰上的研磨器中充分研磨。用移液器吸1 mL的研磨液至1.5 mL的離心管內(nèi),反復凍融3次,加入0.25 mL的1萬單位的雙抗,混勻。4℃,過夜。8 000 r/min離心5 min,取上清,經(jīng)0.22 nm濾器過濾除菌,—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)及病毒分離 待BHK-21細胞生長成70%～80%單層時,吸棄生長液,接種制備好的病料上清1 mL,同時接種1 mL PBS作為陰性對照組,37℃吸附1 h后換細胞維持液培養(yǎng)。每隔12 h觀察一次細胞的生長狀況。出現(xiàn)CPE后或36 h后收毒,將細胞反復凍融3次,4 000 r/m in離心10 min,取上清留作提取病毒基因組RNA。

1.2.3 細胞病毒液RNA的提取 取病毒液250 μ L,TRNzol 750 μ L加入到DEPC處理過的EP管內(nèi),混勻,冰上放置5 min。4℃,12 000 r/min離心15 min,吸取上清至新的EP管內(nèi),向上清加入150 μ L的氯仿,劇烈震蕩15 S,冰上靜置10 min。4℃,12 000 r/min離心15 min,此時樣品分成三層:黃色的有機相,中間層和上層無色的水相,RNA主要在水相中,把水相(約600 μ L)轉移至新的離心管中,加入等體積的異丙醇,混勻,—20℃放置1 h～2 h。4℃,12 000 r/min離心15 min,棄上清,加入400 μ L 750 mL/L乙醇,顛倒清洗5 min,4℃,5 000 r/min離心5 min,棄上清,加入350 μ L 750 mL/L乙醇,顛倒清洗數(shù)次,棄上清,室溫放置晾干。加入20 μ L的Rnase-free ddH2O,反復吹打,混勻,充分溶解RNA。

1.2.4 反轉錄 采用EMCV下游引物,參照全式金反轉錄酶說明書合成cDNA,具體做法如下:

20 μ L反應體系:

RNasin 0.5 μ L,RNA提取物10 μ L,下游引物0.5 μ L,5×RT buffer 4 μ L,10 mmol/L dNTPs 4 μ L,反轉錄酶1 μ L。

其反轉錄過程在PCR儀中進行,其反應程序如下:42℃,30 min,85℃,5 min。

1.2.5 PCR擴增 引物濃度為25 pmol/μ L,dNTPs每種濃度為2.5 mmol/L,Tap酶為5 U/μ L,整個PCR反應體系為25 μ L,反應成分如下:10×buffer 2.5 μ L,dNTPs 2 μ L,上下游引物各為0.5 μ L,模板DNA 3 μ L,Tap酶0.5 μ L,加高壓滅菌三蒸水至16 μ L,混勻,將混合物94℃預變性5 min后,進入PCR循環(huán),按94℃1 min,46℃1 min,72℃1 min,31個循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的檢測 取3 μ LPC R產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,以Marker作為DNA標準,紫外燈下觀察擴增片段大小,并拍照記錄結果以出現(xiàn)300 bp條帶的為EMCV陽性,出現(xiàn)其他條帶為EMCV陰性。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)及病毒分離

將病料處理液接種BHK-21細胞(圖1A),繼續(xù)培養(yǎng),BD1無明顯病變(圖1B),BD2接種的細胞8 h出現(xiàn)病變,病變形式為細胞圓縮、崩解(圖1C)。

圖1 細胞培養(yǎng)結果Fig.1 The results of cell culture

2.2 細胞毒的PCR檢測結果

從上述BD1、BD2細胞病毒液中提取RNA,做RT-PCR,進行瓊脂糖凝膠電泳,結果見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.2 The results of PCR

3 討論

病料研磨后,經(jīng)反復凍融促使病毒從細胞中完全釋放出來,再將上清接種BHK-21細胞。由于引起豬繁殖障礙的其他病毒如:PRRSV,PCV2,PRV,PPV和CSFV等在BHK-21細胞系上均不能增殖[12]。病料在細胞上引起明顯的特征性的細胞病變?nèi)缪杆倨屏?、崩解?即可以作出初步判斷,經(jīng)RT-PCR進一步鑒定后,最終確定為豬腦心肌炎病毒。

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