淫羊藿超聲提取工藝優(yōu)化

高 冷，鮑 磊，王谷媛，龔殿鵬

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

淫羊藿具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，其有效成分主要為淫羊藿苷、總黃酮及多糖[2],具有多方面的藥理作用。臨床應(yīng)用廣泛[3],淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分,分子式為C33H40O15，分子量676.75，結(jié)構(gòu)式如下：

本文以淫羊藿苷的提取率為指標(biāo),通過正交實(shí)驗(yàn)分析各因素對(duì)提取率的影響，優(yōu)選出較佳的超聲提取工藝條件，以促進(jìn)淫羊藿的進(jìn)一步合理開發(fā)利用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、原料及藥品

SCIENT2-HF2000超聲波循環(huán)提取機(jī)；Agilent1100高效液相色譜儀；LGJ-30冷凍干燥機(jī)；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋；GL-21LM型離心機(jī)；R501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；索氏提取器；電子天平。

長(zhǎng)白山淫羊藿葉；淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品；乙醇（A.R.）；蒸餾水；甲醇（色譜純）。

1.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]

稱取干燥的淫羊藿粗粉20g，過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，用乙醇作溶劑超聲提取,得到的粗提液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200mL，離心后冷凍干燥至干,干燥至恒重,得粗提物。超聲功率達(dá)到300W以上時(shí)提取率趨于恒定，故選定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液固比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）作為考察因素,每個(gè)因素各取3個(gè)水平,采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 淫羊藿苷樣品溶液的配制

稱取10 mg干燥的粗提物,置50mL容量瓶中加入40mL甲醇,超聲溶解10 min定容。取部分溶液離心吸取上清液,用微孔濾膜（0.45um）過濾取續(xù)濾液作為樣品溶液備用。

1.4 HLPC檢測(cè)方法

1.4.1 HLPC標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 照2005版藥典如下操作:精密稱取淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇，超聲加熱使其充分溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每lmL含0.lmg的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。

1.4.2 HLPC測(cè)定條件及方法[5,6]流動(dòng)相的選擇：經(jīng)過流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水（60∶40）的流動(dòng)相分離完全，保留時(shí)間適宜，其他成分分離較好，無干擾，選定為適宜流動(dòng)相；色譜柱ZORBAX SB-C18；保留時(shí)間15min；以淫羊藿苷為標(biāo)品在波長(zhǎng)270nm進(jìn)行測(cè)定。最后進(jìn)行色譜分析：取5μL標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣提取液進(jìn)高效液相色譜分析，以保留時(shí)間定性，用峰面積外標(biāo)法定量計(jì)算試樣中物質(zhì)含量。

1.4.3 HLPC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取1.4.1項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL分置于 10mL刻度比色管中（相當(dāng)于 0、5、10、15、20、25、30μg·mL-1）分別加甲醇定容至刻度，搖勻；在270nm波長(zhǎng)處做HPLC檢測(cè)，并計(jì)算回歸峰面積。以峰面積對(duì)濃度做回歸處理，5～30ug·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，并得到回歸方程為:Y=192.22X-12.153，R2=0.9983。

1.4.4 淫羊藿的HLPC圖譜

圖1 淫羊藿標(biāo)準(zhǔn)樣的HLPC圖譜Fig.1 HLPC chromatogram of herba epimedii standard sample

圖2 淫羊藿超聲最佳工藝提取物HLPC圖譜Fig.2 HLPC chromatogram of extractive of herba epimedii by best technology

由圖1、2可以看出，提取物和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相同，證明所提取的物質(zhì)是淫羊藿苷。

1.5 淫羊藿葉中淫羊藿苷總含量測(cè)定

稱取20 g干燥的淫羊藿粗粉3份,分別在索氏提取器中用甲醇回流提取,直至提取液無顏色為止,提取液減壓濃縮、冷凍干燥至恒重,得粗提取物。其質(zhì)量取3次的平均值為4.42g。按1.4項(xiàng)步驟配制樣品溶液,取3次結(jié)果的平均值,得淫羊藿中淫羊藿苷的含量為2.98%,偏差為0.01。

1.6 提取率的計(jì)算

淫羊藿苷的提取率=樣品中淫羊藿苷檢測(cè)含量/淫羊藿葉中淫羊藿苷總含量。

1.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)篩選得到的最佳工藝提取3批樣品,測(cè)定淫羊藿苷含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 淫羊藿苷提取

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表1，方差分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal test

表1結(jié)果表明，對(duì)淫羊藿苷提取率影響的主次因素為乙醇濃度（A）＞液固比（B）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（C）,最佳提取工藝條件是A2B3C1D2,即60%乙醇溶液、液固比25∶1、提取時(shí)間60min、提取溫度50℃,在此條件下淫羊藿苷的提取率為94.98%。

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

表2結(jié)果表明，因素A、B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著,因素C、D則對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝條件穩(wěn)定可行,平均提取率為94.88%。

2.3 淫羊藿最佳提取工藝

超聲功率為300W、60%乙醇溶液、液固比25∶1、提取時(shí)間60min、提取溫度50℃。根據(jù)優(yōu)選工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,有效成分提取率94.88%,重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

超聲波對(duì)固體樣品的提取效果很明顯，它促進(jìn)和加速了提取過程，而且還可避免高溫對(duì)目標(biāo)成分的破壞,目標(biāo)物易分離，能達(dá)到比常規(guī)提取更理想的效果。超聲提取方法較其它常規(guī)提取方法具有提取時(shí)間短、提取溫度低、提取率提高明顯的優(yōu)點(diǎn)，更適合于大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

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