DBA/1小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型建立方法及評價指標(biāo)

張玲玲，劉云潔，童 彤，吳穎其，趙文娣，李培培，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所·抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·抗炎免疫藥物安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以損害滑膜、軟骨和骨的一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾?。?］。小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)是用于闡明關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及研究新的治療藥物的RA動物模型［2］。CIA模型是Trentham等1977年首次建立的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎動物模型，20世紀(jì)80年代至90年代初期，國外大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)并在臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)和免疫學(xué)等方面進(jìn)行了廣泛深入的研究。雞、小牛、大鼠的Ⅱ型膠原(typeⅡcollagen，CⅡ)均能引起關(guān)節(jié)炎。選擇的動物一般為嚙齒類和靈長類［3］。本文描述了雞CⅡ免疫DBA/1小鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的方法及評價CIA模型的主要指標(biāo)，包括關(guān)節(jié)炎指數(shù)、體重、足爪X線、踝關(guān)節(jié)及脾臟病理觀察及評分等。與以往的CIA模型建立方法比較，本實(shí)驗(yàn)中CIA建立方法可靠，重復(fù)性好，CIA發(fā)病率高。該方法及評價指標(biāo)將為建立CIA模型研究RA病理機(jī)制及評價RA治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 動物DBA/1小鼠(7～8周)，♂性，體質(zhì)量(18+2)g，SPF級，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，合格證號:SCXK(滬)2008-0017。

2.2 藥物和試劑卡介苗:北京生物制品所產(chǎn)品，批號20090324;Ⅱ型膠原:Sigma公司(No 9007－34－5);完全弗氏佐劑(CFA):Sigma公司，含卡介苗(1 g·L－1)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組DBA/1小鼠，隨機(jī)分為2組，即正常組、模型組，每組10只。

2.4 CIA模型的制備［4］于d 0，每只小鼠尾根部、背部多點(diǎn)(4～5點(diǎn))皮內(nèi)注射100 μg雞CⅡ和完全弗氏佐劑［CFA，含卡介苗(1 mg·ml－1)，共 0.1 ml］。d 21，尾根部、背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射同等劑量的該乳劑作為激發(fā)。

2.5 檢測指標(biāo):

2.5.1 大體指標(biāo)觀察 (1)全身病變:每周測量體重變化，觀察前后足爪病變的發(fā)生情況。(2)關(guān)節(jié)炎指數(shù)［5］:第一次免疫后，每隔3 d，進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。按0～4五級評分，0=無紅腫;1=小趾關(guān)節(jié)稍腫;2=趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3=踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4=包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。

2.5.2 踝關(guān)節(jié) X 片［6］在致炎 d 70，脫臼處死小鼠，剪下包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的四肢足爪進(jìn)行X線攝片(Revolution XR/d型數(shù)字化X線成像儀:GE公司)，觀察有無骨質(zhì)溶解和骨贅形成等。

2.5.3 踝關(guān)節(jié)和脾臟病理學(xué)觀察［7］

2.5.3.1 踝關(guān)節(jié)病理檢查及病理學(xué)評分 處死小鼠，取后足炎性踝關(guān)節(jié)進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化，并進(jìn)行病理評分。踝關(guān)節(jié)病理分別從滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕評分。

①滑膜細(xì)胞增殖評分:0=無增殖;1=輕微增殖，2～4層滑膜細(xì)胞;2=中度增殖，4層以上滑膜細(xì)胞;3=滑膜細(xì)胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關(guān)節(jié)間隙消失。

②細(xì)胞侵蝕評分:0=無侵蝕;1=較少的局部侵蝕;2=廣泛的局部侵蝕;3=廣泛侵蝕到關(guān)節(jié)囊，伴有凝聚體的形成。

③血管翳評分:0=無改變;1=兩個部位出現(xiàn)血管翳;2=4個部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕;3=4個以上部位出現(xiàn)血管翳或二個部位出現(xiàn)大范圍的血管翳。

④炎癥評分:0=正常;1=輕度炎癥，出現(xiàn)1個聚集物或較少的分散白細(xì)胞浸潤;2=中度炎癥，2個或2個以上的白細(xì)胞聚集物;3=重度炎癥，白細(xì)胞融合、分散浸潤明顯。

⑤骨質(zhì)侵蝕評分:0=正常;1=小量侵蝕，1～2個小的淺部位;2=少量侵蝕，1～4個中等大小和深度部位;3=中等侵蝕，5個以上部位，局部侵蝕到骨皮質(zhì);4=重度侵蝕，多重?fù)p傷，局部或完全侵蝕到骨皮質(zhì);5=廣泛損傷，皮質(zhì)穿透骨長度的25%以上。

2.5.3.2 脾臟病理檢查及病理學(xué)評分 處死小鼠，取脾臟進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化，并進(jìn)行病理評分。脾臟病理從動脈周圍淋巴鞘的細(xì)胞密度、淋巴小結(jié)增生(淋巴樣濾泡)、邊緣區(qū)增生、紅髓充血和生發(fā)中心的總數(shù)量進(jìn)行判定，按照病變從輕到重進(jìn)行0～3(0=正常)級病理評分。

①動脈周圍淋巴鞘的細(xì)胞密度評分:0=正常;1=細(xì)胞密度輕微增大;2=細(xì)胞密度中度增大，有細(xì)胞擁擠;3=細(xì)胞密度重度增大，有細(xì)胞擁擠疊加。

②淋巴小結(jié)增生評分:0=無增生，生發(fā)中心極少或無;1=輕微增生，可見生發(fā)中心;2=中度增生，生發(fā)中心明顯;3=過度增生，細(xì)胞密度增大，生發(fā)中心多見。

③ 邊緣區(qū)增生評分:0=無增生，混有少量紅細(xì)胞;1=輕微增生，邊緣區(qū)輕度增寬;2=中度增生，邊緣區(qū)明顯增寬，紅細(xì)胞減少;3=重度增生，與白髓界限模糊。

④ 紅髓充血評分:0=無充血;1=輕微充血，脾臟血量輕度最多;2=中度充血;紅髓中固有的細(xì)胞成分減少，在小梁或被膜附近可見一些被血液排擠的淋巴組織;3=脾髓內(nèi)充盈大量血液，紅髓中固有的細(xì)胞成分大為減少，小梁或被膜附近明顯可見被血液排擠的淋巴組織。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 11.5和SAS 8.02軟件處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察CIA小鼠前后足爪病變情況d 0將CⅡ乳劑于DBA/1小鼠的尾根部皮內(nèi)注射0.1 ml致炎，d 21將相同劑量CⅡ乳劑0.1 ml在尾根部皮內(nèi)注射，作為激發(fā)。d 31小鼠足爪出現(xiàn)紅腫，首先是前足紅腫，以后延伸到后足，有的表現(xiàn)為足掌紅腫，有的表現(xiàn)為趾指紅腫，似梅花狀。d 40～60為腫脹高峰，d 70后，足爪腫脹仍然存在(Fig 1A，B)。

Fig 1 Swelling paws in mice with CIA

3.2 CIA小鼠體重變化小鼠免疫后，每周測定小鼠體重，觀察體重變化，d 35開始，CIA組小鼠體重開始下降，體重增加值與正常組體重增加值比較，差異有顯著性，一直持續(xù)到d 70(Fig 2)。

Fig 2 Weight change in mice with CIA

3.3 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分情況第一次免疫后，每隔3天，進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。d 31，CIA小鼠足爪出現(xiàn)紅腫，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均值為3.44，隨著病程延長，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸升高，在 d 47～63，指數(shù)均值達(dá)7.0左右(Fig 3A，B)。

3.4 CIA小鼠足爪X片改變d 70，脫臼處死小鼠，取下小鼠包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的前后足爪，進(jìn)行X線射片。與正常組比較，CIA組小鼠足爪關(guān)節(jié)變形，有骨贅生成，伴有骨質(zhì)溶解(Fig 4A，4B)。

3.5 CIA小鼠踝關(guān)節(jié)病理變化及評分d 70，脫臼處死小鼠，取足爪踝關(guān)節(jié)，進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化。正常小鼠滑膜組織無增生，襯覆1－2層滑膜細(xì)胞，無炎細(xì)胞浸潤，無血管擴(kuò)張充血，無血管翳;CIA小鼠踝關(guān)節(jié)明顯可以看到滑膜組織增生，襯覆多層滑膜細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，血管翳出現(xiàn)(Fig 5A，5B)。分別對正常組和CIA組小鼠踝關(guān)節(jié)病理從滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕進(jìn)行評分，結(jié)果顯示正常組小鼠各指標(biāo)病理評分為0，CIA組小鼠各指標(biāo)病理評分均值明顯增高(Tab 1)。

3.6 CIA小鼠脾臟病理變化及評分d 70，脫臼處死小鼠，分離脾臟，進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化。與正常組比較，CIA組小鼠脾臟生發(fā)中心增多，白髓淋巴樣濾泡增生明顯，邊緣區(qū)細(xì)胞密度增大、紅髓淤血(Fig 6A，6B)。同時從動脈周圍淋巴鞘的細(xì)胞密度、淋巴小結(jié)(淋巴樣濾泡增生)、邊緣區(qū)細(xì)胞密度、紅髓淤血和生發(fā)中心總數(shù)量，按照病變從輕到重進(jìn)行0～3(0=正常)級病理評分。結(jié)果顯示CIA組小鼠脾臟病理各指標(biāo)分值均值明顯高于正常組小鼠(Tab 2)。

4 討論

CIA小鼠表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫，嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形。病理變化為增生性滑膜炎，關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，伴有炎性細(xì)胞浸潤。體內(nèi)可檢出針對自身Ⅱ型膠原的高滴度的IgG抗體。這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與人RA密切相關(guān)，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型［3，8］。

Tab 1 Histological pathology scores of ankle joints in CIA mice(+s，n=10)

Tab 1 Histological pathology scores of ankle joints in CIA mice(+s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal

Group Synovial hyperplasia Cell infiltration Pannus Inflammation Bone erosion Normal 0 0 0 0 0 CIA 2.77 ±0.61＊＊ 1.95 ±0.84＊＊ 2.36 ±1.09＊＊ 1.77 ±0.81＊＊ 1.13 ±1.03＊＊

Tab 2 Histological pathology scores of spleen in CIA mice(+s，n=10)

Tab 2 Histological pathology scores of spleen in CIA mice(+s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs normal.

Group Germinal center Cell density lymphatic sheath Lymphoid follicular hyperplasia Marg inal zone Red pulp Normal 1.82 ±1.40 0.92 ±0.51 1.08 ±0.67 0.67 ±0.49 0.42 ±0.15 CIA 4.25 ±1.48＊＊ 2.05 ±0.82＊＊ 2.45 ±0.60＊＊ 2.00 ±0.65＊＊ 2.50 ±0.69＊＊

Fig 3 Scores of arthritis index in mice with CIA

Fig 4 Paw X-ray photos in mice with CIA

Fig 5 Histological pathology of ankle joints in CIA mice(HE staining，×100).

Fig 6 Histological pathology of spleen tissue in CIA mice(HE staining，×40).

DBA近交系小鼠，是所有近交系小鼠中最早的，1909年Little博士曾在毛色遺傳實(shí)驗(yàn)中使用。1929～1930年培育成幾個品系，美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室目前培育有DBA/1和DBA/2等亞系。DBA/1小鼠被廣泛用于建立RA模型，用II型膠原蛋白免疫可引起自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。DBA/1小鼠誘導(dǎo)CIA的發(fā)病率高，在90%左右，小于100%。DBA/1小鼠CIA顯示滑膜炎、軟骨和骨侵蝕等病理變化，類似于人 RA 的臨床病理改變［9－10］。

本實(shí)驗(yàn)中我們以雞CⅡ免疫7～8 wk♂性DBA/1小鼠。免疫后d 31，小鼠足爪出現(xiàn)紅腫，首先是前足紅腫，延伸到后足，并伴有體重下降，關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨著病程延長，逐漸升高。CIA小鼠足爪X線片顯示足爪關(guān)節(jié)變形，有骨贅生成，伴有骨質(zhì)溶解。CIA小鼠足爪踝關(guān)節(jié)病理明顯可以看到滑膜組織增生，襯覆多層滑膜細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，血管翳出現(xiàn)。CIA小鼠脾臟病理可見生發(fā)中心增多，白髓淋巴樣濾泡增生明顯，邊緣區(qū)細(xì)胞密度增大、紅髓充血。這些病理改變及體征與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

總之，雞CⅡ免疫DBA/1小鼠誘導(dǎo)CIA動物模型，其病理改變和體征較大程度反映了RA的發(fā)病情況，該方法可靠，重復(fù)性好，CIA發(fā)病率高。關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足爪X線片、踝關(guān)節(jié)和脾臟病理等是評價CIA模型的主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)描述的DBA/1小鼠建立CIA的主要方法和主要評價指標(biāo)，為進(jìn)一步了解RA致病機(jī)制和評價新藥提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 陳鏡宇，吳華勛，陳 尹，等.膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織G蛋白偶聯(lián)受體激酶的表達(dá)及白芍總苷對其的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(3):421 －3.

［1］ Chen J Y，Wu H X，Chen Y，et al.Expression of GRKs in synovia l tissue from ra ts with collagen-induced arthritis and the effect of total glucosides of paeony［J］.Chin Pharmacal Bull，2008，24(3):421－3.

［2］ Bevaart L，Vervoordeldonk M J，Tak P P.Collagen-induced arthritis in mice［J］.Methods Mol Biol，2010，602:181 －92.

［3］ 張玲玲，沈玉先，魏 偉.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型與臨床的關(guān)系［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(5):502 －6.

［3］ Zhang L L，Shen Y X，Wei W.Relation between animal models of RA and clinic［J］.Chin Pharmacal Bull，2002，18(5):502 －6.

［4］ Simelyte E，Criado G，Essex D，et al.CD200-Fc，a novel antiarthritic biologic agent that targets proinflammatory cytokine expression in the joints of mice with collagen-induced arthritis［J］.Arthritis Rheum，2008，58(4):1038 －43.

［5］ 張玲玲，魏 偉，汪慶童，等.芍藥苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)信號的調(diào)節(jié)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(3):300－5.

［5］ Zhang L L，Wei W，Wang Q T，et al.Regula tory effects of Paeoniflorin on G protein-coupled signaling of synoviocytes in collagen-induced arthritis rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):330 －5.

［6］ Wang H，Marsters S A，Baker T，et al.TACI-ligand interactions are required for T cell activation and collagen induced arthritis in mice［J］.Nat Immunol，2001，2(7):632 －7.

［7］ 魏 偉，吳希美，李元建 主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第4版，北京:人民衛(wèi)生出版社，印刷中.

［7］ Wei W，Wu XM，Li YJ eds.Methodology of pharmacological experiment［M］.Beijing:People’s Medical Publishing House，in press

［8］ Lee S W，Kim J H，Park Y B，Lee S K.Bortezomib attenuates murine collagen-induced arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2009，68(11):1761－7.

［9］ Lories R J，Matthys P，de Vlam K，et al.Ankylosing enthesitis，dactylitis，and onychoperiostitis in male DBA/1 mice:a model of psoriatic arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2004，63(5):595 －8.

［10］ JAX?Mice database［OL］.(http://jaxmice.jax.org/strain/000670.html).